2025, Vol. 54文章信息
- 张希, 张蒙, 李江, 徐成阳
- ZHANG Xi, ZHANG Meng, LI Jiang, XU Chengyang
- 淫羊藿苷对脓毒症心肌损伤大鼠心肌细胞凋亡和TGF-β1/Smad3信号通路的影响
- Effects of icariin on myocardial cell apoptosis and TGF-β1/Smad3 signaling pathway in rats with septic myocardial damage
- 中国医科大学学报, 2025, 54(8): 697-701, 708
- Journal of China Medical University, 2025, 54(8): 697-701, 708
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文章历史
- 收稿日期：2024-09-23
- 网络出版时间：2025-07-29 11:19:03
引用本文 |
2. 河南省人民医院全科医学科, 郑州 450000
2. Department of General Practice, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450000, China
脓毒症是感染引发的一种全身炎症性疾病，可造成心功能衰竭，是脓毒症患者死亡的主要原因[1-2]。炎症反应引发的心肌细胞凋亡是造成脓毒症心肌损伤的病理基础，抑制炎症和心肌细胞凋亡是防治脓毒症患者心肌损伤的关键环节[3-4]。转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）/Smad3作为重要的炎症调控信号，与脓毒症并发症的发展密切相关，抑制其激活可减轻脓毒症诱导的炎症和肝细胞凋亡[5-6]，阻止TGF-β1/Smad3信号传导还可改善心肌梗死大鼠的心功能[7]。植物性化学物质是治疗心血管疾病药物的重要来源，淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，可通过抑制硫氧还蛋白相互作用蛋白减轻心肌细胞损伤[8]，还能减轻病毒性心肌炎小鼠的心肌组织损伤[9]，还可通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路激活减轻心肌梗死的大鼠心脏重塑[10]。本研究通过构建脓毒症心肌损伤大鼠模型，探究淫羊藿苷对其心肌细胞凋亡的影响，阐明TGF-β1/Smad3信号通路的作用机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器淫羊藿苷（含量94.2%，批号：110737-201516），购自中国食品药品检定研究院。脂多糖（纯度≥90%，货号：0000153963），购自美国Sigma公司。TGF-β信号通路激活剂SRI-011381（纯度99.39%，货号：HY-100347），购自美国MCE公司。HE染色试剂盒，HRP-TUNEL检测试剂盒，大鼠心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T，cTnT）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme-MB，CK-MB）、白细胞介素-6（interlenkin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）酶联免疫吸附试验试剂盒，兔抗大鼠TGF-β1、Smad3、GAPDH和p-Smad3一抗，HRP-山羊抗兔二抗，购自英国abcam公司。
L22-8K3小动物超声成像仪，购自珂纳医疗科技（苏州）有限公司；HistoCore MULTICUT R切片机、DMi1倒置显微镜、UC Enuity超薄切片机，购自德国Leica公司；HT7800透射电子显微镜，购自日立科学仪器（北京）有限公司；Trans-Blot SD 1703940垂直电泳转印系统、iMark酶标仪、ChemiDoc MP荧光成像系统，购自美国Bio-Rad公司。
1.2 实验动物和分组51只SPF级、7周龄、200~230 g的SD雄性大鼠，购自江西中医药大学实验动物科技中心，生产许可证号为SCXK（赣）2023-0001。在22~25 ℃、SPF级动物房内常规饲养，室内相对湿度保持在50%~60%，维持明暗（12 h/12 h）交替光照，大鼠自由进食饮水。本实验获得郑州铁路职业技术学院伦理委员会审批通过，审批号：（2023）伦审第（45）号。
取41只SD大鼠，用生理盐水溶解脂多糖，以20 mg/kg的剂量腹腔注射，构建脓毒症心肌损伤大鼠模型[11]。30 min后观察，大鼠出现精神萎靡、食欲不振、呼吸急促、体温升高等症状，且超声检查大鼠发生心功能障碍，提示造模成功。大鼠成功造模40只，死亡1只。将40只脓毒症心肌损伤大鼠随机分为模型组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷高剂量组、淫羊藿苷高剂量+SRI-011381组，每组10只。另取10只SD大鼠，腹腔注射等量生理盐水，设为对照组。淫羊藿苷低剂量组和高剂量组大鼠在注射脂多糖后30 min分别给予80和160 mg/kg淫羊藿苷灌胃（1次/d，共7 d）[9]。淫羊藿苷高剂量+SRI-011381组大鼠在注射脂多糖后30 min给予160 mg/kg淫羊藿苷灌胃（1次/d，共7 d）和2.5 mg/kg SRI-011381腹腔注射（1次/d，共7 d）[12]。对照组和模型组大鼠以等量生理盐水灌胃（1次/d，共7 d）和腹腔注射（1次/d，共7 d）。
1.3 方法 1.3.1 大鼠心功能检测末次给药后24 h，采用超声诊断仪检查大鼠心功能，分析左心室功能指标，包括左心室舒张末内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收缩末内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室收缩压（left ventricular systolic pressure，LVSP）。
1.3.2 大鼠心肌组织标本采集和病理学检查用乙醚麻醉大鼠后采集颈动脉血，离心采集血清，用于后续心肌损伤标志物和炎性细胞因子水平的检测。颈椎脱臼法处死大鼠，摘取心脏，取约250 mg任意部位心肌组织保存在液氮内。取约1 mm3的心肌组织固定、脱水、包埋、聚合后，切成40~50 nm的超薄切片备用。取约1 cm3的心肌组织固定、脱水、包埋后，切成约5~10 µm的切片，脱蜡至水、透明后行HE染色，显微镜下观察大鼠心肌组织形态并拍照，依据心肌组织炎症浸润、心肌细胞坏死病变面积进行病理评分[11]，病变面积为0%、> 0%~ < 25%、25%~ < 50%、50%~ < 75%、≥75%~100%分别计为0、1、2、3、4分。
1.3.3 大鼠心肌超微结构检测取40~50 nm的大鼠心肌组织超薄切片，用醋酸铀、柠檬酸铅溶液进行双染后，电镜下观察大鼠心肌组织超微结构。
1.3.4 大鼠心肌细胞凋亡检测取大鼠心肌组织超薄切片，TUNEL染色后显微镜下观察、拍照，计数大鼠凋亡心肌细胞（棕色）数和细胞总数，计算心肌细胞凋亡率，心肌细胞凋亡率（%）=心肌细胞凋亡数/细胞总数×100。
1.3.5 大鼠血清心肌损伤标志物和炎性细胞因子水平检测取离心后的大鼠血清，解冻后用酶标仪检测cTnT、CK-MB、IL-6和TNF-α水平，具体方法参照酶联免疫吸附试验试剂盒说明书。
1.3.6 大鼠心肌组织TGF-β1/Smad3通路相关蛋白表达检测于预冷的RIPA中匀浆，提取大鼠心肌组织总蛋白，测定浓度。取20 µg心肌组织总蛋白进行变性、上样、电泳和全湿电转，封闭处理后分别孵育抗体，TGF-β1、Smad3、GAPDH和p-Smad3一抗均稀释2 000倍，于4 ℃下孵育，HRP-山羊抗兔二抗稀释1 000倍，于37 ℃下孵育。各组蛋白显色后拍照，定量其灰度值后，将GAPDH作为内参，分析各组蛋白相对表达水平。
1.4 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组大鼠心功能的比较与对照组比较，模型组大鼠LVEDD、LVESD升高（P < 0.05），LVEF、LVSP降低（P < 0.05）。与模型组比较，淫羊藿苷低剂量和高剂量组大鼠LVEDD、LVESD均降低（P < 0.05），LVEF、LVSP均升高（P < 0.05）。与淫羊藿苷低剂量组比较，淫羊藿苷高剂量组大鼠LVEDD、LVESD进一步降低（P < 0.05），LVEF、LVSP进一步升高（P < 0.05）。与淫羊藿苷高剂量组比较，淫羊藿苷高剂量+SRI-011381组大鼠LVEDD、LVESD升高（P < 0.05），LVEF、LVSP降低（P < 0.05）。见表 1。
| Group | LVEDD（mm） | LVESD（mm） | LVEF（%） | LVSP（mmHg） |
| Control | 5.25±0.41 | 3.12±0.29 | 83.46±9.16 | 161.96±12.31 |
| Model | 9.37±0.621） | 6.79±0.521） | 42.95±5.921） | 58.71±9.261） |
| Low-dose icariin | 7.40±0.542） | 4.98±0.472） | 61.84±6.502） | 108.54±10.252） |
| High-dose icariin | 5.39±0.432），3） | 3.24±0.382），3） | 81.53±8.422），3） | 157.83±11.932），3） |
| High-dose icariin+SRI-011381 | 9.24±0.594） | 6.62±0.454） | 44.67±5.154） | 60.23±9.174） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. low-dose icariin group；4）P < 0.05 vs. high-dose icariin group. | ||||
2.2 各组大鼠心肌组织病理超微结构和心肌细胞凋亡的比较
对照组、模型组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷高剂量组、淫羊藿苷高剂量+SRI-011381组心肌病理评分分别为（0.00±0.00）分、（3.10±0.63）分、（1.70±0.54）分、（0.50±0.50）分、（2.80±0.71）分，心肌细胞凋亡率分别为（2.47±0.80）%、（41.23±1.73）%、（22.10±1.52）%、（3.56±0.97）%、（39.84±1.84）%。模型组心肌病理评分、心肌细胞凋亡率高于对照组（P < 0.05）；淫羊藿苷低剂量和高剂量组心肌病理评分、心肌细胞凋亡率低于模型组（P < 0.05）；淫羊藿苷高剂量组心肌病理评分、心肌细胞凋亡率低于淫羊藿苷低剂量组（P < 0.05）；淫羊藿苷高剂量+SRI-011381组心肌病理评分、心肌细胞凋亡率高于淫羊藿苷高剂量组（P < 0.05）。
对照组大鼠心肌组织无病理损伤，心肌横纹清晰，纤维排列整齐，心肌细胞形态正常；心肌组织超微结构完好，心肌细胞结构完整，染色质分布均匀，线粒体嵴结构正常且数量丰富，肌纤维清晰可辨。模型组大鼠心肌组织发生明显病理损伤，心肌横纹模糊，纤维部分断裂且排列紊乱，心肌细胞变性死亡；心肌组织超微结构发生明显损伤，心肌细胞结构受损，染色质聚集，线粒体嵴结构破损、部分消失，肌纤维松散且排列紊乱，肌节界限不清，肌丝和肌节局部形成溶灶点。见图 1~3。
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| A, control group; B, model group; C, low-dose icariin group; D, high-dose icariin group; E, high-dose icariin+SRI-011381 group. 图 1 透射电镜下观察5组大鼠心肌组织形态和超微结构 ×8 000 Fig.1 Morphology and ultrastructure of myocardial tissue of rats among the five groups observed by transmission electron microscopy ×8 000 |
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| A, control group; B, model group; C, low-dose icariin group; D, high-dose icariin group; E, high-dose icariin+SRI-011381 group. 图 2 5组大鼠心肌组织HE染色 ×200 Fig.2 HE staining of myocardial tissue of rats among the five groups ×200 |
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| A, control group; B, model group; C, low-dose icariin group; D, high-dose icariin group; E, high-dose icariin+SRI-011381 group. 图 3 5组大鼠心肌组织TUNEL染色 ×200 Fig.3 TUNEL staining of myocardial tissue of rats among the five groups ×200 |
2.3 各组大鼠血清心肌损伤标志物、炎性细胞因子水平以及心肌组织TGF-β1/Smad3通路相关蛋白表达水平的比较
与对照组比较，模型组大鼠血清cTnT、CK-MB、IL-6、TNF-α水平以及心肌组织TGF-β1蛋白表达水平、p-Smad3/Smad3均升高（P < 0.05）。与模型组比较，淫羊藿苷低剂量组和高剂量组大鼠血清cTnT、CK-MB、IL-6、TNF-α水平以及心肌组织TGF-β1蛋白表达水平、p-Smad3/Smad3均降低（P < 0.05）。与淫羊藿苷低剂量组比较，淫羊藿苷高剂量组大鼠上述指标水平进一步降低（P < 0.05）。与淫羊藿苷高剂量组比较，淫羊藿苷高剂量+SRI-011381组大鼠血清cTnT、CK-MB、IL-6、TNF-α水平以及心肌组织TGF-β1蛋白表达水平、p-Smad3/Smad3均升高（P < 0.05）。见表 2、图 4。
| Group | cTnT（pg/mL） | CK-MB（kU/L） | IL-6（pg/mL） | TNF-α（pg/mL） | TGF-β1 | p-Smad3/Smad3 |
| Control | 186.79±26.13 | 41.35±7.28 | 76.43±12.34 | 56.45±10.36 | 0.11±0.02 | 0.09±0.01 |
| Model | 675.83±35.241） | 174.67±11.531） | 435.35±18.521） | 374.36±16.531） | 0.87±0.091） | 0.87±0.081） |
| Low-dose icariin | 432.52±30.462） | 117.42±9.362） | 263.61±15.732） | 223.89±14.802） | 0.45±0.052） | 0.46±0.052） |
| High-dose icariin | 198.65±25.342），3） | 46.21±8.152），3） | 84.92±13.402），3） | 63.54±11.452），3） | 0.13±0.032），3） | 0.10±0.022），3） |
| High-dose icariin+SRI-011381 | 663.98±32.514） | 167.18±10.844） | 421.76±14.614） | 364.65±15.344） | 0.84±0.084） | 0.85±0.074） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. low-dose icariin group；4）P < 0.05 vs. high-dose icariin group. | ||||||
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| 1, control group; 2, model group; 3, low-dose icariin group; 4, high-dose icariin group; 5, high-dose icariin+SRI-011381 group. 图 4 5组大鼠心肌组织TGF-β1/Smad3通路相关蛋白表达 Fig.4 Expression of TGF-β1/Smad3 pathway-related proteins in myocardial tissue of rats among the five groups |
3 讨论
脓毒症引发的全身炎症反应贯穿了脓毒症所致心肌损伤的起始和病情进展阶段，是造成心肌细胞大量凋亡的主要因素，因此治疗脓毒症心肌损伤的有效策略是限制并减轻炎症[3-4]。淫羊藿苷对心肌梗死有治疗作用[13]，并可通过抑制炎症治疗脓毒症相关性脑病[14]。因而推测，淫羊藿苷可能用于治疗脓毒症心肌损伤。本研究结果显示，用淫羊藿苷干预脓毒症心肌损伤大鼠，可降低炎性细胞因子IL-6与TNF-α水平，阻止炎症的发生和发展，进而减轻大鼠心肌组织形态和超微结构病理损伤，并降低LVEDD、LVESD、心肌病理评分、心肌细胞凋亡率，升高LVEF、LVSP。本研究结果提示，淫羊藿苷可通过抑制炎症减轻脓毒症大鼠炎症，进而减轻其心肌细胞凋亡和心肌组织损伤，改善其心功能，且淫羊藿苷剂量越高，其对脓毒症大鼠心肌损伤的改善作用越强。
TGF-β1/Smad3信号通路调控炎症和细胞凋亡过程，可减轻脓毒症大鼠心脏重塑[15]。本研究结果显示，脓毒症心肌损伤大鼠心肌组织中TGF-β1蛋白表达、p-Smad3/Smad3升高，淫羊藿苷干预可逆转蛋白表达变化趋势，表明TGF-β1/Smad3信号通路参与脓毒症心肌损伤的发生，并介导淫羊藿苷对脓毒症心肌损伤大鼠的治疗过程；用淫羊藿苷和TGF-β1信号通路激活剂SRI-011381联合干预脓毒症心肌损伤大鼠，可减弱淫羊藿苷单独干预对脓毒症心肌损伤大鼠炎症的抑制作用，消除其对脓毒症心肌损伤大鼠心肌细胞凋亡和心肌组织损伤的保护作用，最终干扰其对脓毒症心肌损伤大鼠心功能的改善作用。本研究结果揭示，淫羊藿苷减轻脓毒症心肌损伤大鼠心肌细胞凋亡是通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路激活实现的。
综上所述，淫羊藿苷可减少脓毒症大鼠炎性细胞因子产生，阻止炎症反应的发生和进展，进而减轻心肌细胞凋亡，缓解心肌组织损伤，最终改善心功能。抑制TGF-β1/Smad3信号通路激活是淫羊藿苷发挥上述心肌保护作用的药理机制之一。本研究证实了淫羊藿苷对脓毒症心肌损伤的治疗潜力，并阐明了TGF-β1/Smad3信号通路在其中的作用机制，为淫羊藿苷用于临床治疗提供了一定理论依据。
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