不孕症是指经过1年以上时间未采取任何避孕措施，且性生活正常的情况下却未能成功妊娠的症状。治疗不孕症一般采取输卵管或盆腔整形手术等手段，对于手术治疗后仍未自然妊娠的患者，临床多建议采用体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）技术提高临床妊娠率^[1]。目前，临床上认为颗粒细胞氧化应激与行IVF-ET治疗不孕症患者的妊娠率之间存在一定联系 ^[2]。氧化应激状态是指人体内机体活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量过高或是人体本身抗氧化能力下降导致对ROS清除不足，造成氧化以及抗氧化系统失衡，引起细胞氧化损伤的病理过程^[3]。临床上主要通过丙二醛（malondialdehyde，MDA）以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）监测氧化应激状态，本研究拟探讨颗粒细胞氧化应激及凋亡对胚胎发育及IVF-ET结局的影响。

1 材料与方法 1.1 一般资料

选取2023年3月至2024年3月于我科行IVF-ET的不孕症患者60例，均采用长方案或拮抗剂方案助排卵，年龄28~34岁，平均年龄（31.27±2.24）岁，不孕年限2.4~3.5年，平均不孕年限（2.93±0.31）年。本研究经中国人民解放军北部战区总医院医学伦理委员会审批通过，患者均知情并签署同意书。

1.2 方法

长方案患者于月经周期的第18~22天开始，利用促性腺激素释放激素激动剂（gonado-tropin-releasing hormone agonist，GnRH-a）肌肉注射进行垂体降调节（1次/d），持续治疗2周后，检测患者血液中的雌激素黄体生成素、促卵泡生成素水平，并用三维超声测量子宫内膜厚度，明确是否满足降调标准。若观察患者黄体生成素 < 5 U/L，雌二醇 < 180 pmol/L，促卵泡生成素 < 5 U/L，子宫内膜厚度 < 5 mm，且未发现功能性囊肿，则给予患者促性腺激素（gonadotropin，Gn）进行卵巢刺激，初始注射剂量为100~300 U/d，注射后利用超声观察卵泡生长情况，并适当调节卵泡生长速度。拮抗剂方案患者于月经周期的第2~4天开始注射Gn，初始剂量为100~200 U/d，根据注射后患者血清激素水平及超声下卵泡生长情况，灵活添加GnRH。当患者优势卵泡直径 > 12 mm时，给予GnRH拮抗剂皮下注射（0.25 mg/d），持续注射至扳机日。若超声发现患者至少存在2个直径 > 18 mm或至少存在3个直径 > 17 mm的卵泡，则给予患者重组人绒促性素250 μg或人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）4 000 U。在扳机日后约36 h实施超声引导下穿刺取卵术，取卵结束后通过阴道给予黄体酮胶囊（600 mg），并实施常规IVF授精。在体外受精后第3天胚胎卵裂球达到4个细胞以上，胚胎分级1~2级，则进行移植或冷冻，作为可利用胚胎，其余胚胎作为囊胚培养。在IVF-ET结束后采集卵内剩余卵泡液，检测SOD及MDA的表达水平。

1.3 观察指标

在移植后的第28天患者进行超声检查，确定患者是否妊娠。根据妊娠情况进行分组，其中妊娠组38例，未妊娠组22例。观察2组患者胚胎发育情况及氧化应激指标。在IVF-ET结束后采集卵内剩余卵泡液，行红细胞分离后获取颗粒细胞悬浮液，离心，使用BD FACS CantoⅡ流式细胞分析仪（杭州德适生物科技股份有限公司）进行细胞凋亡率检测，用硫代巴比妥酸法对SOD、MDA水平进行测定，SOD、MDA试剂盒购自上海恒远生物技术有限公司。观察凋亡率、氧化应激指标与IVF-ET相关指标（获卵数、成熟卵子数、受精率、卵裂率、优胚率）之间的相关性，其中，优胚率（%）=优质胚胎数/受精卵数×100。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0进行统计分析，计量资料以x±s表示，采用t检验进行比较；计数资料以率（%）表示，采用χ²检验进行比较；IVF-ET结局与氧化应激指标的相关性采用Spearman相关分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 2组IVF-ET相关指标比较

2组优胚率、凋亡率、MDA、SOD等IVF-ET相关指标比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），见表 1。

2.2 凋亡率、氧化应激指标与IVF-ET相关指标的相关性分析

相关性分析结果显示，凋亡率与获卵数、成熟卵子数密切相关，MDA与受精率密切相关（P均 < 0.05）；而SOD与IVF-ET相关指标间均无明显相关性（P > 0.05），见表 2。

3 讨论

女性生殖细胞的丢失与细胞凋亡之间存在紧密联系，颗粒细胞的凋亡在这一过程之中发挥重要作用^[4]。卵母细胞的凋亡是卵泡闭锁的开始阶段，颗粒细胞凋亡则是导致卵泡出现退化的主要原因^[5]。目前，研究^[6]认为颗粒细胞的凋亡与获卵数之间存在一定联系，颗粒细胞的凋亡可能会导致卵泡闭锁，从而减少成熟卵子数量。

本研究中妊娠组与未妊娠组在优胚率、凋亡率等方面均存在统计学差异（P < 0.05）。颗粒细胞凋亡与卵子质量之间也存在紧密联系，在凋亡率偏高的情况下，卵子发育潜能也会受到不良影响，从而改变妊娠结局。在氧化应激反应发生时，患者体内积蓄过多ROS会对细胞大分子造成直接损伤，导致DNA及线粒体DNA发生突变或裂解，使细胞内部重要酶失活；且细胞膜脂质发生过氧化，直接改变膜流动性，同时蛋白液会在此状态之下受到氧化应激反应损伤，导致重要酶失活，从而引发细胞凋亡^[7-8]。在本研究中，妊娠组与未妊娠组在MDA、SOD等方面均存在明显差异（P < 0.05）。这表明未妊娠患者多处于氧化应激以及抗氧化失衡状态，因此，初步推断颗粒细胞氧化应激是引起颗粒细胞凋亡的主要原因之一。在培养卵泡的过程中，加入适量抗氧化剂能够在一定程度上抑制细胞凋亡进程，这一现象能够间接证明氧化应激会导致细胞凋亡。本研究结果显示，凋亡率与获卵数、成熟卵子数之间显著相关，MDA与受精率显著相关（P均 < 0.05），SOD与IVF-ET相关指标均不相关（P > 0.05）。刘忠慧等^[9]发现，SOD水平与妊娠率之间并无显著相关性，刘景等^[10]研究发现，卵泡液中的SOD水平与受精率、胚胎质量之间并无显著相关性，可能是因为获卵数、受精率、胚胎质量等受多种因素的影响，而SOD只是其中的一个因素，其单独的作用并不明显。部分研究^[11-13]发现，为行IVF-ET的不孕症患者提供适量叶酸或锌可在一定程度上改善患者ROS水平和氧化应激状态，从而提高卵子质量水平和妊娠成功率，这进一步提示了ROS可能会引起卵子质量的下降，而颗粒细胞氧化应激则会直接降低卵子的受精能力，影响妊娠结局。对氧化应激状态下的不孕症患者而言，颗粒细胞中生成的过量ROS会直接加速细胞本身的凋亡速度，使卵子失去颗粒细胞的保护，从而破坏体内激素的调节能力，影响卵子的正常发育。

综上所述，颗粒细胞氧化应激会加快细胞本身的凋亡，提高细胞凋亡率，降低卵泡质量，从而对卵子发育造成负面影响，导致不良妊娠结局。