口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC) 为口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，2020年全球口腔癌死亡近18万例(占全部癌症的1.8%)，新增近38万例(占全部癌症的2%) ^[1]。近年来，OSCC的治疗策略和手术技术取得了进展^[2]，目前的治疗方法主要是手术切除、放化疗和免疫治疗。但由于术后复发和远处转移，OSCC患者的预后较差，5年总生存率为50%~64%^[3-5]。巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，MCSF) 在多种肿瘤(如肾癌、膀胱癌) 中高表达。高MCSF表达水平与乳腺癌、子宫内膜样癌、卵巢上皮瘤、平滑肌肉瘤和乳头状肾细胞癌的病理分级更高、转移更频繁以及预后更差相关^[6-10]。降低血浆MCSF水平可促进人乳头瘤病毒阳性大鼠宫颈癌细胞凋亡，有效抑制细胞增殖^[11]。本课题组前期研究^[12]发现，MCSF在OSCC患者血清中表达水平升高，在OSCC细胞系和OSCC裸鼠模型中表达水平也明显升高。本研究通过免疫组织化学法和Western blotting证实了MCSF在OSCC中高表达，并通过体外实验探索了MCSF对OSCC细胞系HSC-4迁移、增殖和凋亡能力的影响。

1 材料与方法 1.1 标本和试剂

1.1.1 标本

收集西南医科大学附属口腔医院口腔颌面外科收治的5例病理确诊为OSCC的患者的口腔黏膜组织(OSCC组)，同期收集5例拔除阻生第三磨牙患者的正常牙龈组织(正常对照组)。所有OSCC患者术前未接受化疗或放疗，且6个月内未服用激素药物或免疫抑制药物。排除患有其他恶性肿瘤、口腔黏膜病变或严重全身性疾病的患者。5例OSCC患者中，男3例，女2例；平均年龄(54.20±9.52) 岁。健康对照者的正常牙龈组织无炎症和异常增生。5例健康对照者中，男3例，女2例；平均年龄(44.20±8.87) 岁。OSCC患者与健康对照者比较，年龄和性别均无统计学差异(P > 0.05)。本研究经西南医科大学附属口腔医院医学伦理委员会批准，所有研究对象知情同意。

1.1.2 细胞和主要试剂

OSCC细胞系HSC-4、人永生化角质形成细胞系Hacat，购自中国科学院典型培养物保管委员会细胞库；通用SP试剂盒(小鼠/兔链霉素卵白素-生物素法检测系统)、DAB显色试剂盒，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；MCSF抗体，购自上海埃必威生物技术有限公司；一管式反转录试剂盒、2×Universal SYBR Green qPCR Premix试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒，购自上海圣尔生物科技有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；shRNA干扰MCSF(shMCSF) 和shNC(阴性对照)，购自和元生物技术(上海) 股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色

将组织脱蜡并在柠檬酸中煮沸，3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性10 min，抗MCSF抗体4 ℃下孵育过夜。第2天用PBS洗涤载玻片，并与生物素标记的二抗在37 ℃下孵育15 min。洗涤后，切片与辣根过氧化物酶复合物在37 ℃下孵育15 min，使用DAB进行显色。苏木精染色，0.5%盐酸乙醇分化，将载玻片置于乙醇和二甲苯中梯度脱水，封片后在光学显微镜下观察染色结果。

1.2.2 免疫细胞化学染色

在无菌的盖玻片上培养HSC-4和Hacat细胞，进行免疫细胞化学染色。用4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS洗涤，再用去离子化过氧化氢抑制内源性过氧化物酶活性10 min，其余步骤与免疫组织化学染色相同。

1.2.3 Western blotting

使用RIPA裂解液提取肿瘤组织和细胞中的总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒评估蛋白浓度。通过SDS-PAGE分离蛋白质，转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭膜1 h，在4 ℃下一抗孵育过夜。用TBST洗涤后，室温二抗孵育2 h。使用ECL显影液进行化学发光检测。

1.2.4 细胞培养以及MCSF基因干扰转染与筛选

将HSC-4和Hacat细胞于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM高糖培养基中培养，条件为37 ℃、5%CO2，细胞融合度为85%~90%时进行消化传代。将细胞分为空白对照组、shNC组、shMCSF组。空白对照组，未转染处理；shNC组，为阴性对照，转染无序列质粒载体病毒；shMCSF组，转染沉默MCSF质粒载体慢病毒。

将细胞按2×10⁵/孔的密度于6孔板中铺板，细胞融合度达70%时，加入shNC和shMCSF转染序列慢病毒，同时加入5 μg/mL聚凝胺提高转染效率。16 h后更换培养基继续培养，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达情况，确认感染成功后加入2 μg/mL嘌呤霉素处理3 d，筛选出稳定转染细胞株。转染序列均为正向，具体如下：shNC，5’-CCGGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGTTTTTTG-3’；shMCSF，5’-CCGGTTGACAAGGACTGGAATATTTCTCGAGAAATATTCCAGTCCTTGTCAATTTTTTG-3’。

1.2.5 实时定量PCR和Western blotting鉴定MCSF敲低效果

采用TRIzol法提取细胞RNA，使用一管式反转录试剂盒进行逆转录。使用2×Universal SYBR Green qPCR Premix试剂盒进行实时定量PCR。实时定量PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 30 s，40个循环；其中GAPDH为内参。采用2^-ΔΔCt法计算MCSF mRNA相对表达量。Western blotting步骤同1.2.3。

1.2.6 划痕实验

取对数生长期的HSC-4细胞铺板，细胞密度为5×10⁵/孔，至细胞密度达到90%时，用移液器枪头垂直于6孔板底做划痕，PBS洗去划痕缝隙细胞，加入无血清培养基，于0、24、48 h拍照并记录细胞愈合情况。使用ImageJ软件记录划痕面积。

1.2.7 Transwell实验

使用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×10⁵/mL。在24孔板的底部加入含10%胎牛血清的完全培养基600 μL，向Transwell小室加入上述备好的细胞悬液200 μL。培养24 h，固定后DAPI染液染色，荧光显微镜下拍照、计数。

1.2.8 细胞集落形成实验

按500/孔的细胞密度向6孔板中加入细胞，培养7~10 d，直至肉眼可见白色细胞团块。当显微镜下克隆细胞数量 > 50个且细胞团未融合时，采用4%多聚甲醛固定，0.5%结晶紫染色，拍照。

1.2.9 细胞凋亡检测实验

使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡能力。将细胞于无菌的盖玻片上培养24 h，PBS洗涤盖玻片后4%多聚甲醛固定，PBS洗涤后0.1% Triton X-100通透细胞，将末端脱氧核苷酸转移酶和2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸按照试剂盒说明书推荐比例配置TUNEL反应混合液。向样本加入反应混合液，37 ℃避光孵育2 h，PBS洗涤后加入DAPI染液染色，荧光显微镜下观察阳性结果，并拍照、记录。

1.3 统计学分析

采用GraphaPad Prism 9.0进行绘图和统计学分析。计量资料用x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MCSF在OSCC中高表达

为验证MCSF在OSCC中的表达情况，对OSCC组织、正常牙龈组织、HSC-4细胞和Hacat细胞进行免疫组织化学染色和Western blotting检测。结果显示，MCSF在OSCC组织和HSC-4细胞中高表达。见图 1。

2.2 shMCSF转染效率检测

荧光显微镜下观察，空白对照组细胞无荧光，shNC组和shMCSF组有大量荧光。见图 2A。为了检测转染效果，采用实时定量PCR检测MCSF mRNA表达，采用Western blotting检测MCSF蛋白表达。结果显示，与空白对照组比较，shNC组MCSF mRNA和蛋白表达水平无明显改变，shMCSF组MCSF mRNA和蛋白表达水平明显降低。见图 2B、2C。因此，后续实验只设shNC组作为对照。

2.3 敲低MCSF抑制HSC-4细胞的迁移能力

细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验结果显示，与shNC组比较，shMCSF组细胞迁移能力明显降低(P < 0.05)，见图 3。

2.4 敲低MCSF抑制HSC-4细胞增殖、促进HSC-4细胞凋亡

细胞集落形成实验结果显示，与shNC组比较，shMCSF组细胞增殖能力降低(P < 0.05)，见图 4A。细胞凋亡实验结果显示，与shNC组比较，shMCSF组细胞凋亡率升高(P < 0.05)，见图 4B。

3 讨论

OSCC的发病机制复杂，一般认为与吸烟、过量饮酒等有关，手术是OSCC的首选治疗方法^[13]，但传统的手术治疗和放化疗等治疗方法不能有效提高治愈率、延长生存期、改善生活质量。目前，新型分子靶向治疗因其治疗特异性强、效果显著、基本不损伤正常组织的优点，成为新的研究热点。发现可能的治疗靶点，为提高OSCC的治疗效果提供了新的可能。

MCSF在多种肿瘤中表达，且与癌症进展密切相关。研究^[14]表明，MCSF可以作为糖蛋白或含硫酸软骨素的蛋白聚糖分泌到血液中，也可以作为跨膜糖蛋白在合成细胞表面表达。集落刺激因子1受体(colony stimulating factor 1 receptor，CSF-1R) 为MCSF受体，在乳腺癌中，MCSF不仅在旁分泌途径与巨噬细胞上的CSF-1R结合起作用，还通过肿瘤细胞自分泌与肿瘤细胞上的CSF-1R结合起作用，二者共同促进癌症侵袭。还有研究^[15]表明，MCSF在OSCC中表达率较高(52%)，其表达上调与淋巴结转移及临床分期密切相关。高MCSF水平与肿瘤相关巨噬细胞浸润水平升高呈正相关。异种移植模型研究显示，MCSF信号阻断抑制肿瘤生长，MCSF表达与肿瘤相关巨噬细胞浸润同步显著降低。但MCSF对OSCC细胞生长、增殖和迁移能力的影响尚无研究报道。因此，对MCSF在OSCC中进行细胞水平的研究，为寻找治疗OSCC的靶点提供了新的可能。

本研究的目的是探究MCSF在OSCC组织和人正常牙龈组织、OSCC细胞系HSC-4和人永生化角质形成细胞系Hacat中的表达差异，并探讨MCSF对HSC-4细胞迁移、增殖、凋亡能力的影响。本研究结果显示，MCSF在OSCC组织和细胞中高表达；此外，本研究通过敲低HSC-4细胞中MSCF，利用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验检测HSC-4细胞迁移能力，发现敲低MCSF的HSC-4细胞迁移能力降低；细胞集落形成实验结果显示，敲低MCSF的HCS-4细胞增殖能力减弱；并且敲低MCSF可以促进HSC-4细胞凋亡。但MCSF影响HSC-4细胞迁移、增殖和凋亡能力的具体机制尚不清楚。

综上所述，本研究阐明了MCSF在OSCC组织和细胞中的表达情况，并通过体外实验验证了MCSF对OSCC细胞生物学行为的影响，为临床分子靶向治疗OSCC提供了可能的新靶点。