头颈部鳞状细胞癌是最常见的癌症类型之一，其中口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC) 占90%^[1]。人乳头瘤病毒感染、吸烟、酗酒以及咀嚼槟榔是OSCC的主要致病因素^[2]。临床中发现，OSCC患者易发生淋巴结转移，在确诊时多已是晚期，手术切除、放化疗以及免疫疗法被视为治疗OSCC的标准方法，然而由于肿瘤的易转移性，治疗后患者的5年生存率仍不超过50%^[3]。因此，需进一步探索更有效的治疗方法。

细胞焦亡是一种程序性细胞死亡形式，由胱天蛋白酶(caspase) 参与激活，通过消皮素蛋白家族在质膜上形成孔隙，导致胞膜完整性被破坏，进而释放大量胞内物质和炎性细胞因子^[4]。研究^[5]表明，抗肿瘤疗法可导致肿瘤细胞以包括细胞凋亡、细胞焦亡和铁死亡在内的多种方式死亡，而易发生焦亡的肿瘤细胞对化疗药物更敏感。因此，探索肿瘤细胞焦亡的发生和发展机制，对于制定抗肿瘤策略至关重要。

Notch信号通路是一种进化上高度保守的信号转导通路，在多种细胞发育过程中扮演关键角色，其在肿瘤中与肿瘤干细胞的增殖、分化和肿瘤潜在的侵袭或转移密切相关^[6]。CB-103作为一种Notch信号通路抑制剂，已被证明可在多种类型肿瘤中发挥抗肿瘤作用^[6-7]。无论是单独使用还是与靶向治疗联合应用，CB-103均在临床前模型中表现出强大的抗肿瘤活性^[8]。然而，CB-103在OSCC治疗中的作用目前尚不完全清楚。本研究通过探索CB-103对OSCC细胞的影响并分析相关作用机制，为CB-103临床试验的开展及其应用提供依据。

1 材料与方法 1.1 主要材料和试剂

OSCC细胞系SCC-7，购自美国模式培养物集存库；消皮素E(gasdermin E，GSDME)抗体，购自英国abcam公司；caspase-3抗体、高迁移率组蛋白1(high-mobility group box 1，HMGB1)抗体，购自美国CST公司；ATP检测试剂盒、活性氧(reactive oxygen species，ROS) 检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术股份有限公司；CB-103，购自美国MedChemExpress公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养SCC-7细胞，在37 ℃、5%CO₂培养箱中传代培养。

1.2.2 细胞活力检测

以1×10⁵/孔的细胞密度将SCC-7细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后使用不同浓度(0、20、40、60、80、100 μg/mL) 的CB-103处理细胞，采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性。重复接种操作，在细胞贴壁后通过划痕实验观察不同浓度(0、10、20 μg/mL) 的CB-103处理细胞后划痕宽度的变化。

1.2.3 细胞形态学检测

以1×10⁵/孔的细胞密度将SCC-7细胞接种于6孔板中，细胞贴壁后加入不同浓度(0、50、100 μg/mL) 的CB-103，倒置显微镜下监测细胞形态随时间的变化情况，采集图像。

1.2.4 OSCC相关蛋白表达水平检测

用不同浓度(0、20、40、60、80、100 μg/mL) 的CB-103处理SCC-7细胞。收集不同处理条件下的各组细胞，加裂解液提取蛋白，测定蛋白浓度。记录完成后依次进行上样，电泳，转膜。加入GSDME、caspase-3和β肌动蛋白(β-actin)一抗孵育液，4 ℃过夜。第2天用TBST洗膜3次，加入二抗孵育液，室温孵育2 h，洗膜3次。显影、曝光后采集图像，应用ImageJ软件进行分析。

1.2.5 细胞ATP和HMGB1释放水平以及细胞内ROS水平检测

以1×10⁵/孔的细胞密度将SCC-7细胞接种于6孔板中，分别加入不同浓度(0、20、40、60、80、100 μg/mL) 的CB-103处理细胞24 h，去除细胞培养液，洗涤，采用ATP检测试剂盒检测ATP水平，采用免疫荧光法检测HMGB1水平。配置ROS染色工作液，处理细胞后，荧光显微镜下观察细胞内ROS水平。采集各组图像，进行统计分析。

1.3 统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0软件进行数据分析和绘图。计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CB-103抑制OSCC细胞增殖活性和细胞迁移

使用不同浓度(0、20、40、60、80、100 μg/mL) 的CB-103处理SCC-7细胞，应用CCK-8试剂盒检测细胞活性和增殖情况。0、20、40、60、80、100 μg/mL CB-103组SCC-7细胞的相对活力分别为100%、(86.27±3.41) %、（74.87±3.81) %、(61.67±14.8) %、(47.13±1.49) %、(37.52±6.68) %。与对照组(0 μg/mL) 相比，40、60、80、100 μg/mL CB-103组SCC-7细胞增殖活性均降低(均P < 0.05)；且60、80、100 μg/mL CB-103组与20 μg/mL CB-103组相比，80、100 μg/mL CB-103组与40 μg/mL CB-103组相比，100 μg/mL CB-103组与60 μg/mL CB-103组相比，SCC-7细胞增殖活性均降低(均P < 0.05)。结果提示，CB-103浓度越高，SCC-7细胞增殖活性越低。

在CB-103处理细胞0、12、24和36 h后，通过划痕实验观察细胞迁移情况。结果(图 1) 显示，与对照组(0 μg/mL) 相比，10和20 μg/mL CB-103组SCC-7细胞的迁移能力均降低，且随着CB-103浓度的增加，细胞迁移被抑制现象更明显。上述结果表明，CB-103对OSCC细胞的生长和迁移具有显著抑制作用。

2.2 CB-103诱导OSCC细胞产生焦亡样表型

为了进一步探究CB-103抑制OSCC细胞的作用机制，倒置显微镜下实时观察和拍摄不同浓度(0、50、100 μg/mL) 的CB-103处理SCC-7细胞24 h后细胞的生长和形态变化。结果(图 2) 显示，与对照组(0 μg/mL) 相比，50和100 μg/mL CB-103组的SCC-7细胞均出现细胞肿胀和细胞膜上形成大量气泡的焦亡样表型，且随着CB-103浓度的增加，发生溶胀崩解和内容物释放的细胞数量增加。结果表明，发生焦亡的细胞数量增加且与CB-103浓度相关。

2.3 CB-103通过caspase-3/GSDME通路诱导OSCC细胞焦亡

为了分析CB-103诱导OSCC细胞发生焦亡的分子机制，应用Western blotting检测细胞中GSDME、GSDME-N端片段以及裂解caspase-3(cleaved caspase-3) 的表达水平。结果(图 3) 显示，与对照组(0 μg/mL) 相比，50和100 μg/mL CB-103组SCC-7细胞中GSDME-N端和cleaved caspase-3的相对表达量明显增加(P < 0.05)。

2.4 CB-103使细胞中ATP和HMGB1水平升高

用不同浓度(0、20、40、60、80、100 μg/mL) 的CB-103处理SCC-7细胞后，应用ATP检测试剂盒检测细胞内ATP水平的变化。结果(图 4A) 显示，与对照组(0 μg/mL) 相比，40、60、80、100 μg/mL CB-103组SCC-7细胞中ATP水平显著升高(均P < 0.05)。除100 μg/mL CB-103组外，细胞中ATP释放水平呈CB-103浓度依赖性。

应用免疫荧光法检测细胞中HMGB1水平的变化。结果(图 4B) 显示，与对照组(0 μg/mL) 相比，20、40、60、80、100 μg/mL CB-103组SCC-7细胞中HMGB1水平逐渐降低。以上结果表明，在CB-103的刺激下，SCC-7细胞发生焦亡，胞膜溶胀崩解，通透性改变，引起细胞内炎性物质ATP和HMGB1从细胞中逐渐释放至细胞外。

2.5 CB-103引起细胞中ROS水平升高

为进一步探究CB-103诱导OSCC细胞发生caspase-3/GSDME通路依赖性焦亡的调控机制，本研究检测了在CB-103刺激下SCC-7细胞中ROS水平的变化。用不同浓度(0、20、40、60、80、100 μg/mL) 的CB-103刺激SCC-7细胞，结果(图 5) 显示，与对照组(0 μg/mL) 相比，20、40、60、80、100 μg/mL CB-103组SCC-7细胞内ROS水平均显著增加，且这种刺激作用程度与CB-103浓度相关。结果表明，CB-103可能通过改变OSCC细胞内的ROS水平，诱导细胞焦亡。

3 讨论

鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，好发于舌、颊、牙龈等部位，因其发生部位的特殊性，严重影响患者的生存和生活质量。目前，OSCC患者面临治疗抵抗频发以及5年生存率较低的问题，因此亟待探索更有效的治疗策略。

CB-103是一种高度特异性的蛋白质-蛋白质相互作用抑制剂，可干扰Notch受体活性胞内结构域与CSL转录因子复合物间的相互作用，导致致癌途径激活的转录下调^[9]。为了探索CB-103在治疗OSCC过程中发挥的作用，本研究使用不同浓度的CB-103处理SCC-7细胞，结果发现，CB-103可诱导细胞发生焦亡。

当细胞发生焦亡时，在质膜上形成大量孔隙，最终引起细胞破裂，释放细胞内容物，从而激活强烈的炎症和免疫反应^[4]。本研究发现，CB-103刺激SCC-7细胞后，细胞增殖活性和细胞迁移运动被明显抑制。显微镜下观察，可见癌细胞肿胀变形，胞膜上形成突出物，最终破裂崩解，这表明了细胞焦亡的发生。由此表明，CB-103可通过促进OSCC细胞发生焦亡，进而发挥抗肿瘤作用。

GSDME是消皮素家族中成孔蛋白的前体，而消皮素家族蛋白的分裂可引发细胞焦亡^[10]。本研究发现，在CB-103的刺激下，SCC-7细胞中GSDME以浓度和时间依赖性方式被激活，细胞中cleaved caspase-3蛋白的表达量以及GSDME-N端片段数量均明显增加，说明cleaved caspase-3在细胞中发挥剪切GSDME蛋白的作用。由于天然切割位点的存在，激活的caspase-3可以切割GSDME的特定位点，释放活性N末端结构域，介导细胞穿孔，并释放大量炎性细胞因子以诱导细胞焦亡^[11]。因此，CB-103可通过caspase-3/GSDME途径诱导OSCC细胞焦亡。

本研究发现，随着CB-103浓度的增加，SCC-7细胞中ATP释放水平显著升高，HMGB1水平逐渐降低。本研究中，100 μg/mL CB-103组与40、60、80 μg/mL CB-103组相比，细胞中ATP释放水平降低，这是因为100 μg/mL的CB-103浓度较高，使得细胞过早死亡，ATP释放出后被降解，因此在检测时环境内ATP水平已经降低。这些结果证明了细胞膜完整性被破坏，炎症内容物被释放。ATP可激活嘌呤能受体P2X配体门控离子通道，破坏质膜的完整度，扰乱质膜对K⁺的通透性，导致胞质中K⁺浓度降低，从而参与激活炎症小体NLRP3。炎症小体是细胞内的蛋白质复合物，可激活炎性caspase，诱导免疫反应和焦亡^[12]。

为了探究影响caspase-3/GSDME信号通路诱导细胞焦亡的上游调控分子，本研究用不同浓度梯度的CB-103处理SCC-7细胞，发现细胞中ROS水平显著升高。先前有研究^[13]发现，过量的ROS可以促进细胞内GSDME活化。线粒体是细胞ATP和关键代谢物的主要来源，过量的ROS是线粒体功能障碍的副产物，是线粒体膜氧化损伤和通透性改变的典型特征^[14]。此外，线粒体与NLRP3炎症小体间的直接或间接相互作用可导致线粒体不稳定和NLRP3去泛素化，从而促进NLRP3炎症小体触发焦亡^[15]。因此，本研究结果提示，CB-103可能诱发了线粒体功能障碍，引起肿瘤细胞内ROS释放量增加，从而促进caspase-3/GSDME通路诱导的细胞焦亡。

本研究存在一定的局限性：未充分探究ROS对caspase-3/GSDME信号通路的具体调控蛋白，以及其含量影响细胞焦亡的分子机制。

综上所述，本研究发现CB-103可通过促进OSCC细胞发生焦亡进而发挥抗肿瘤作用，并初步证实了CB-103通过激活ROS/caspase-3/GSDME信号通路诱导细胞焦亡。今后应进一步开展动物实验，以探究CB-103对OSCC负瘤小鼠生存的影响及其浓度变化引发的相关机体反应。