口腔癌是外界物理和化学因素、病原体侵入、颌骨发育异常或其他全身性疾病导致的口腔内发生的恶性肿瘤，严重影响患者的咀嚼和语言能力，同时还影响患者的总体生存质量^[1]。口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC) 是口腔癌中最常见的类型，占所有口腔颌面恶性肿瘤的90%以上，其发病率和死亡率较高，已成为全球性公共卫生问题^[2]。尽管目前有手术、放化疗等治疗方法，但全球范围内OSCC的复发率仍在持续上升。因此，寻找治疗OSCC的有效靶点，对于改善患者的预后具有重要意义。

微RNA(microRNA，miRNA) 是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，通过靶向mRNA的3’非翻译区发挥转录后调节的作用，从而抑制mRNA翻译或诱导其降解^[3]。既往研究^[3-4]显示了miRNA在口腔癌和其他癌症的发生、发展中的作用。let-7是miRNA家族中高度保守的成员，广泛存在于包括人类在内的各种生物体中^[5]。在所有miRNA家族中，let-7家族被公认为是一种生长抑制因子，在膀胱癌、结直肠癌等恶性肿瘤的发病中发挥关键作用^[6]。研究^[7]发现，let-7c在OSCC肿瘤干细胞中表达下调，而let-7c过表达可有效抑制肿瘤干细胞的干性特征并增强放化疗敏感性。

本研究通过分析let-7在OSCC组织和细胞中的表达，探讨let-7过表达或敲低对OSCC细胞恶性行为的影响，进一步阐明let-7对OSCC调控的分子机制，从而为寻找OSCC新的靶向诊断和治疗方法奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 主要材料和试剂

人口腔角质细胞系(HOK)和OSCC细胞系(CAL-27、SCC-25、SCC-9)，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清，购自浙江天杭生物科技股份有限公司；let-7模拟物(mimic)和拮抗剂(antagomir)，lipofectamin 2000，购自上海吉玛制药技术有限公司；TRIzol试剂、Matrigel胶、逆转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒，购自美国Invitrogen公司。

1.1.2 组织样本采集

采集2018年7月至2019年12月于河北医科大学第四医院口腔科接受手术的70例OSCC患者的癌组织和距离癌组织3 cm以上的正常组织。纳入标准：患者年龄≥18岁；经病理检查确诊为OSCC。排除标准：既往确诊OSCC并接受肿瘤相关治疗的患者；其他部位恶性肿瘤患者；资料不全的患者；血液和免疫系统受损的患者；精神疾病患者。患者出院后随访，随访时间截至2024年3月31日，47例患者存活，23例患者死亡，无失访病例。总生存时间指确诊至患者死亡或随访截止时间。本研究获得河北医科大学第四医院伦理委员会批准，患者或其家属签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和分组

在37 ℃、5% CO₂培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基进行细胞培养和传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。将细胞分为空白对照组(NC组)、模拟物阴性对照组(mimic NC组)、let-7模拟物组(let-7 mimic组)、拮抗剂阴性对照组(antagomir NC组) 和let-7拮抗剂组(let-7 antagomir组)。NC组不做转染处理，mimic NC组、let-7 mimic组、antagomir NC组、let-7 antagomir组采用lipo-fectamine 2000试剂，分别将mimic NC、let-7 mimic、antagomir NC、let-7 antagomir转染至SCC-25细胞。孵育48 h后，采用实时定量PCR评估转染效率。

1.2.2 克隆形成实验

将各组细胞以1×10³/孔的密度均匀铺于6孔板中。继续培养14 d后弃去培养基，PBS洗去残余培养基。加入4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗涤3次。加入0.1%结晶紫染色液，室温染色1 h。洗去多余染色液，晾干并拍照。

1.2.3 划痕实验

将各组细胞以5×10⁵/mL的密度接种于6孔板中，待细胞融合后，用200 μL移液器枪头在孔底中央划一条直线，用PBS洗去刮下的细胞，拍照、记录划痕宽度。将6孔板放入细胞培养箱中培养24 h，弃去培养基后加入PBS，洗去残存细胞，光学显微镜下观察0 h和24 h细胞的迁移距离。

1.2.4 Transwell实验

将配备8 μm孔径膜的Transwell小室插入24孔板中，用稀释的Matrigel胶包被膜，培养箱中凝固。每组样品细胞制备成单细胞悬浮液，将200 μL细胞悬浮液加入上室，500 μL含10%胎牛血清的培养基加入下室，恒温培养箱中培养24 h后取出，对下室细胞进行洗涤、固定、结晶紫染色、漂洗处理，倒置显微镜下观察和计数细胞。迁移实验不在膜表面涂Matrigel胶，其余操作与侵袭实验相同。

1.2.5 流式细胞术

处理72 h后收集各组细胞，离心，重悬于缓冲液中，依次用异硫氰酸荧光素溶液10 μL和碘化丙啶溶液10 μL染色，室温避光孵育30 min后，采用FACSCalibur流式细胞仪进行分析。

1.2.6 实时定量PCR

使用TRIzol试剂盒从组织或细胞中提取总RNA，按逆转录试剂盒操作步骤将提取的mRNA反转录成cDNA。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，设置35个循环；其中GAPDH为内参。PCR引物序列：let-7，正向5’-AGCAAGCTTTGGCACCCACCCGTAGAAC-3’，反向5’-AAGGATCCGATGCAGGGACAAGGACAGAA-3’；GAPDH，正向5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，反向5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’。

1.2.7 Western blotting

将各组细胞裂解，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。在10% SDS-PAGE中加入20~30 μg蛋白样品进行电泳分析，然后转移至PDVF膜。随后用5%脱脂奶粉封闭，加入一抗，4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶偶联二抗孵育膜。采用ECL试剂盒检测蛋白条带。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计分析。服从正态分布的计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。计数资料用率(%) 表示，组间比较采用χ²检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 let-7在OSCC组织和细胞中的表达水平

与正常组织(1.35±0.35) 和HOK细胞(2.50±0.05) 相比，OSCC组织(0.45±0.08) 和OSCC细胞[SCC-9细胞(1.20±0.10)、SCC-25细胞(0.95±0.15)、CAL-27细胞(1.60±0.25)]中let-7的表达水平显著降低(P < 0.05)。

2.2 构建let-7过表达和敲低细胞系

选择let-7表达水平较低的SCC-25细胞进行后续实验。分别使用let-7 mimic、antagomir进行细胞转染。结果显示，与mimic NC组、NC组相比，let-7 mimic组SCC-25细胞中let-7表达水平显著升高(P < 0.05)；与antagomir NC组、NC组相比，let-7 antagomir组SCC-25细胞中let-7表达水平显著降低(P < 0.05)，见图 1。

2.3 let-7对SCC-25细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

克隆形成实验结果(图 2A) 显示，let-7过表达后细胞增殖能力被抑制，而let-7敲除后细胞增殖能力增强。划痕实验和Transwell实验结果(图 2B~2D) 显示，let-7过表达后细胞迁移和侵袭能力降低，而let-7敲除后细胞迁袭能力增强。流式细胞术结果(图 2E) 显示，let-7过表达后细胞凋亡增多，而let-7敲除后细胞凋亡减少。

2.4 let-7对Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达的影响

let-7过表达后，SCC-25细胞中Wnt、β-catenin蛋白表达减少，而let-7敲除后Wnt、β-catenin蛋白表达增加。见图 3。

2.5 let-7表达与患者临床病理特征及预后的关系

根据let-7表达水平的中位数，将患者分为let-7高表达组(25例) 和let-7低表达组(45例)。临床病理特征分析结果(表 1) 显示，let-7表达水平与肿瘤分期、淋巴转移和生存状态密切相关(P < 0.05)。Kaplan-Meier生存分析结果(图 4) 显示，let-7低表达患者的中位生存时间显著低于高表达患者(分别为28和35个月，P < 0.05)，总生存率显著低于高表达患者(分别为58%和84%，P < 0.05)。结果表明，let-7高表达对OSCC患者预后产生积极影响。

3 讨论

目前OSCC患者的平均生存率仍较低，且OSCC的潜在机制仍然未知。因此，迫切需要新的诊断生物标志物和治疗策略来改善OSCC患者的预后。研究^[8-9]发现，许多miRNA可以充当“开关”并发挥关键的调控作用。大量研究证明了let-7在各种癌症中的关键调控作用，如let-7c、let-7d表达增加，预示乳头状甲状腺癌的患病风险增加^[10]；let-7促进PD-L1降解，抑制头颈部鳞状细胞癌的免疫逃逸^[11]。

本研究发现，let-7在OSCC组织和细胞中表达下调，表明其可能参与了OSCC的发病和进展。为解析let-7在OSCC发病中的确切机制，本研究在SCC-25细胞中过表达或敲低let-7表达，并进行体外实验。结果表明，let-7过表达显著抑制SCC-25细胞增殖、迁移和侵袭能力，促进细胞凋亡；相反，敲低let-7表达则促进这些恶性表型。以上结果表明，let-7在OSCC发病过程中发挥负调控作用。

Wnt/β-catenin通路是调控细胞发育、分化以及组织稳态的重要功能通路^[12]，其异常激活可能调节重要的生物过程，并与肿瘤的发病、转移和耐药密切相关。大量研究^[13-14]强烈支持其在癌细胞增殖中发挥关键作用。越来越多的证据表明，miRNA通过与肿瘤中Wnt/β-catenin通路的某些靶mRNA相互作用来调节OSCC的发病和进展^[15]。本研究发现，let-7过表达显著降低Wnt/β-catenin通路相关蛋白的表达水平，说明let-7靶向调控Wnt/β-catenin通路，发挥其对SCC-25细胞的抑制作用，但其潜在机制需要进一步研究。此外，let-7表达只与患者临床分期、淋巴转移和生存状态相关。Kaplan-Meier生存分析结果显示，let-7低表达患者的中位生存时间和总生存率较低，可能因为低表达患者容易发生淋巴转移，导致总体预后较差。

综上所述，let-7抑制OSCC细胞增殖、迁移和侵袭，促进凋亡，这些影响可能归因于靶向调控Wnt/β-catenin通路的激活。因此，let-7及其相互作用通路为OSCC的诊断和治疗提供了新的见解，同时也是一种有价值的预后新指标。