2025, Vol. 54文章信息
- 张岳阳, 刘绍明, 焦拥政, 邹迪新, 赵明, 郭海溢
- ZHANG Yueyang, LIU Shaoming, JIAO Yongzheng, ZOU Dixin, ZHAO Ming, GUO Haiyi
- 加味补阳还五汤调节TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对少弱精子症大鼠锌稳态和生殖功能的影响
- Effect of supplemented Buyang Huanwu decoction on zinc homeostasis and reproductive function through TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway regulation in oligoasthenozoospermia rats
- 中国医科大学学报, 2025, 54(6): 510-516
- Journal of China Medical University, 2025, 54(6): 510-516
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文章历史
- 收稿日期：2024-09-29
- 网络出版时间：2025-06-09 14:34:11
引用本文 |
2. 北京中医药大学附属东方医院男科，北京 100078;
3. 中国中医科学院广安门医院男科，北京 100053;
4. 中国中医科学院中药研究所/道地药材品质保障与资源持续利用全国重点实验室，北京 100700;
5. 中国中医科学院望京医院检验科，北京 100102
2. Department of Andrology, Dongfang Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100078, China;
3. Department of Andrology, Guang'anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China;
4. State Key Laboratory for Quality Ensurance and Sustainable Use of Dao-di Herbs, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China;
5. Clinical Laboratory, Wang Jing Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100102, China
少弱精子症（oligoasthenozoospermia，OAS）主要表现为精子数量及活力降低，约占男性不育发病率的75%，是导致男性不育的主要原因之一[1]。因此，积极治疗OAS对于改善不孕不育问题具有重要的临床意义。目前，OAS主要应用促性腺激素、雌激素受体调节剂、芳香酶抑制剂等药物进行治疗，多以经验治疗为主，在治疗上存在疗效不确切及不良反应较多等劣势，具有一定的局限性[2]。研究[3-4]显示，中医药在治疗OAS上显示出独特的优势，其能够通过调节全身代谢，改善内分泌及生殖功能来获得有效治疗，已经成为国内外学者研究的热点。中医学无OAS这一病名，多归属于“精少、精冷、精薄”等范畴，其主要病机多以肾精亏虚为主，夹杂血瘀、湿热、痰浊等，病变以肾、肝、脾部位为主。因此，针对OAS的中医药治疗多为补肾填精法。加味补阳还五汤（supplemented Buyang Huanwu decoction，BYHWD）由黄芪、桃仁、红花、川芎、当归、赤芍、地龙干、蒲黄、菟丝子组成，主要治则与补阳还五汤相同，具有补气活血，化瘀通络，补益肝肾等功效，是中医治疗气血虚血瘀之中风的经典方剂，后被推广使用异病同治用于多种疾病治疗[5-6]。最新研究[7]显示，BYHWD能够改善气虚血瘀型精索静脉曲张术后患者睾丸微循环及精液质量，提示其具有改善OAS的潜在治疗作用。但是，有关BYHWD治疗OAS的作用机制尚不清楚。既往研究[8]显示，锌水平的高低与男性生殖功能密切相关，锌水平降低是导致生殖功能障碍的重要原因之一。此外，研究[9]也证实，炎症反应与男性不育密切相关，炎症相关细胞因子参与了生精微环境的调节，能够直接影响精子的形成以及生精细胞的存活。Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）4/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路与免疫炎症反应密切相关，激活该信号通路能够显著促进炎性细胞因子的合成与释放，触发机体炎症反应[10]。既往研究[11]证实，TLR信号通路的活化与OAS睾丸组织病理损伤密切相关。因此，调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导的免疫炎症反应可能是改善OAS的重要途径。本研究构建OAS大鼠模型，从TLR4/MyD88/NF-κB信号通路角度探讨BYHWD对OAS大鼠生殖功能的影响及其作用机制，旨在为BYHWD治疗OAS提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂和仪器SPF级雄性SD大鼠60只，体重180~200 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[SCXK（沪）2023-0008]。SD大鼠均放置于导科医药实验动物中心饲养，饲养条件：环境温度（22±2）℃，相对湿度50%~60%，光照/黑暗各12 h，自由饮食饮水。本研究获得北京中医药大学医学研究伦理委员会批准（批准号：LLSC2023080347）。
主要试剂包括腺嘌呤（上海麦克林生化科技股份公司，批号C10233004）；睾酮（testosterone，T）、雌二醇（estradiol，E2）、催乳素（prolactin，PRL）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批号H090-1-1、H102-1-2、H095-1-1）；促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、促黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号NM0784604866、NM06TFBN3282）；锌离子荧光探针[范德（北京）生物科技有限责任公司，批号151606-29-0]；醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批号A083-2-1、A059-2-2、A020-2-2）；免疫组织化学检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号SP-9001）；TLR4抗体、MyD88抗体、NF-κB抗体（美国Cell Signaling Technology公司，批号14358、4283、8242）。
主要仪器包括ML-608JZ Ⅲ精子分析仪（南宁市松景天伦生物科技有限公司）、IX73倒置相差显微镜（北京瑞科中仪科技有限公司）、GH17-DR3506型酶标仪（北京海富达科技有限公司）、H-2050R-1型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、KZ-IH-F型低温组织研磨仪（武汉塞维尔生物科技有限公司）、JY-SCZ8型垂直电泳槽及组件（北京君意东方电泳设备有限公司）、Gel dox XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。
1.2 方法 1.2.1 BYHWD药物制备黄芪15 g，桃仁15 g，红花10 g，川芎10 g，当归10 g，赤芍15 g，地龙干10 g，蒲黄10 g，菟丝子15g，均购自北京同仁堂药业有限公司，经中国中医科学院中药研究所/道地药材品质保障与资源持续利用全国重点实验室邹迪新副研究员鉴定为正品，均符合2020版《中国药典》要求。煎煮2次，药液混合后蒸馏浓缩至2 g/mL，每包60 mL，并置于4 ℃冰箱存放备用。
1.2.2 OAS大鼠模型构建、分组及给药将大鼠随机分为对照组（n = 10，control组）和造模组（n = 50）。依据文献[12]对造模组大鼠灌胃处理，给予腺嘌呤（300 mg/kg），1次/d，持续4周。分离睾丸组织进行组织病理学染色，若睾丸组织出现明显的病理结构损伤则表明OAS模型构建成功。将造模成功大鼠随机分为OAS组，左卡尼汀（L-carnitine，0.323 g/kg）组，BYHWD低剂量（BYHWD-L）组、中剂量（BYHWD-M）组、高剂量（BYHWD-H）组，每组10只。BYHWD-L、-M、-H组大鼠按照文献[13]及人体与动物给药剂量换算得出BYHWD灌胃处理给药剂量分别为19.5 g/kg、39 g/kg、78 g/kg；control组和OAS组大鼠给予等量生理盐水灌胃处理。各组大鼠持续干预4周。
1.2.3 精子活力及浓度测定取各组大鼠一侧附睾，置于离心管内，加入3 mL生理盐水（37 ℃），剪碎，使用扩散法收集精子。经CASA系统检测各组大鼠精子数量及精子活力。
1.2.4 大鼠血清激素水平测定干预结束后麻醉大鼠，腹主动脉采血5 mL置于离心管内，3 000 r/min，离心10 min，收集上清液血清，按照ELISA检测试剂盒说明书测定T、E2、FSH、LH、PRL水平。
1.2.5 HE染色观察睾丸组织病理学变化各组大鼠干预结束后取睾丸组织，经4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脱水，常规制备切片，HE染色，光学显微镜下观察睾丸组织病理学变化。
1.2.6 睾丸组织锌总量和含锌酶水平检测分别取50 mg睾丸组织，加入1 mL 65%硝酸，然后微波消解到溶液澄清透明，加入超纯水定容至10 mL，质谱仪检测锌含量。含锌酶水平检测按照检测试剂盒说明书操作完成。
1.2.7 睾丸组织炎性细胞因子测定分别取50 mg睾丸组织，加入9 mL生理盐水（含有RAPA组织裂解液）充分碾磨组织，3 000 r/min，离心10 min，吸取上清液，按照ELISA检测试剂盒说明书检测白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）水平。
1.2.8 免疫组织化学检测TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达各组大鼠睾丸组织切片经3% H2O2溶液孵育、抗原修复、10% BSA溶液封闭非特异性位点；孵育TLR4、MyD88、NF-κB一抗抗体（1∶200），4 ℃孵育16 h；滴加HRP标记的二抗，室温孵育40 min；滴加DAB显色液，显微镜下观察睾丸组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达。每组选取6张切片，每张切片选取3个不同视野观察，通过ImageJ软件分析蛋白相对表达，并计算视野下的平均光密度值。
1.3 统计学分析采取GraphPad Prim 6.0对数据进行统计分析。计量资料采用x±s表示，2组间比较使用独立样本t检验，多组间比较使用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 BYHWD对OAS大鼠一般指标的影响与control组相比，OAS组大鼠体重及睾丸重量略有降低，但差异无统计学意义（P > 0.05）。与OAS组相比，各干预组大鼠体重及睾丸重量略有增加，但差异无统计学意义（P > 0.05）。与control组相比，OAS组大鼠精子活力、精子计数均显著降低（P < 0.05）。与OAS组相比，各BYHWD干预组大鼠精子活力、精子计数均显著升高（P < 0.05），见表 1。
| Group | n | Body weight（g） | Weight of testis（g） | Sperm motility（%） | Sperm count（×106） |
| Control | 10 | 462.23±32.22 | 1.75±0.15 | 55.24±6.10 | 8.20±0.88 |
| OAS | 10 | 435.82±41.34 | 1.65±0.17 | 39.10±2.101） | 3.18±0.601） |
| L-carnitine | 10 | 453.66±39.88 | 1.74±0.18 | 54.29±2.782） | 6.29±0.822） |
| BYHWD-H | 10 | 451.39±40.07 | 1.73±0.11 | 55.02±6.712） | 6.88±0.742） |
| BYHWD-M | 10 | 446.07±31.49 | 1.71±0.19 | 53.22±4.192） | 5.10±0.602） |
| BYHWD-L | 10 | 441.23±41.17 | 1.70±0.16 | 51.19±6.222） | 4.81±0.812） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. OAS group. | |||||
2.2 BYHWD对OAS大鼠血清激素水平的影响
与control组相比，OAS组大鼠血清T和E2水平明显降低，FSH、LH、PRL水平明显升高（P < 0.05）。与OAS组相比，各BYHWD干预组大鼠血清T和E2水平明显升高，FSH、LH、PRL水平明显降低（P < 0.05），见表 2。
| Group | n | T（pg/mL） | E2（pg/mL） | FSH（pg/mL） | LH（pg/mL） | PRL（pg/mL） |
| Control | 10 | 22.17±2.19 | 140.66±12.88 | 6.10±0.72 | 9.26±1.20 | 4.21±0.52 |
| OAS | 10 | 8.19±1.081） | 80.34±8.161） | 14.69±1.131） | 21.44±2.121） | 15.66±1.891） |
| L-carnitine | 10 | 18.92±2.192） | 129.98±10.182） | 7.81±0.692） | 12.77±1.862） | 6.46±0.782） |
| BYHWD-H | 10 | 17.88±1.972） | 126.33±11.452） | 8.12±0.852） | 14.55±1.652） | 7.39±0.912） |
| BYHWD-M | 10 | 15.39±2.012） | 110.28±12.052） | 8.92±1.002） | 15.22±2.002） | 8.44±1.002） |
| BYHWD-L | 10 | 12.97±1.382） | 102.00±11.052） | 9.88±1.122） | 16.33±1.592） | 9.16±1.022） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. OAS group. | ||||||
2.3 BYHWD对OAS大鼠睾丸组织病理形态的影响
HE染色显示，control组大鼠睾丸组织内曲细精管形态，结构正常，各级生精细胞排列整齐，无明显病理学改变。与contol组相比，OAS组大鼠睾丸组织曲细精管明显皱缩、变形，生精小管上皮变薄，生精细胞数量明显减少，排列紊乱，层次不清，且管腔内精子量明显减少。与OAS组相比，各BYHWD干预组大鼠上述病理学改变均明显改善，其中以BYHWD-H组大鼠睾丸组织病理损伤改善最为显著，见图 1。
|
| A, control group; B, OAS group; C, L-carnitine group; D, BYHWD-H group; E, BYHWD-M group; F, BYHWD-L group. The red arrows point to typical seminiferous tubule lesions. 图 1 各组大鼠睾丸组织病理形态学变化HE×100 Fig.1 Pathological and morphological changes in testicular tissue of rats in each group HE×100 |
2.4 BYHWD对OAS大鼠睾丸组织锌含量和含锌酶表达的影响
与control组相比，OAS组大鼠睾丸组织锌含量以及含锌酶ADH、ALP、LDH水平均显著降低（P < 0.05）。与OAS组相比，各药物干预组大鼠睾丸组织锌含量以及含锌酶ADH、ALP、LDH水平均显著升高（P < 0.05），见表 3。
| Group | n | Zinc（μg/mL） | ADH（U/mg） | ALP（U/mg） | LDH（U/mg） |
| Control | 10 | 19.88±1.22 | 3.11±0.81 | 85.66±7.41 | 22.55±2.10 |
| OAS | 10 | 15.21±1.141） | 1.75±0.211） | 39.87±6.251） | 14.10±0.601） |
| L-carnitine | 10 | 18.98±2.012） | 2.79±0.712） | 70.11±8.032） | 20.44±1.182） |
| BYHWD-H | 10 | 19.55±1.772） | 2.89±0.312） | 78.44±6.242） | 22.11±0.892） |
| BYHWD-M | 10 | 18.44±1.062） | 2.67±0.292） | 69.22±6.332） | 19.37±1.102） |
| BYHWD-L | 10 | 18.10±1.732） | 2.45±0.322） | 59.36±6.612） | 18.29±0.692） |
| Control | 10 | 19.88±1.22 | 3.11±0.81 | 85.66±7.41 | 22.55±2.10 |
| OAS | 10 | 15.21±1.141） | 1.75±0.211） | 39.87±6.251） | 14.10±0.601） |
| L-carnitine | 10 | 18.98±2.012） | 2.79±0.712） | 70.11±8.032） | 20.44±1.182） |
| BYHWD-H | 10 | 19.55±1.772） | 2.89±0.312） | 78.44±6.242） | 22.11±0.892） |
| BYHWD-M | 10 | 18.44±1.062） | 2.67±0.292） | 69.22±6.332） | 19.37±1.102） |
| BYHWD-L | 10 | 18.10±1.732） | 2.45±0.322） | 59.36±6.612） | 18.29±0.692） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. OAS group. | |||||
2.5 BYHWD对OAS大鼠睾丸组织炎性细胞因子水平的影响
与control组相比，OAS组大鼠睾丸组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著升高（P < 0.05）。与OAS组相比，各BYHWD干预组大鼠睾丸IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著降低（P < 0.05），见表 4。
| Group | n | IL-1β | IL-6 | TNF-α |
| Control | 10 | 10.66±1.22 | 8.33±1.18 | 18.77±2.10 |
| OAS | 10 | 39.88±4.511） | 22.60±3.021） | 40.22±4.051） |
| L-carnitine | 10 | 21.33±3.392） | 14.77±1.652） | 25.72±3.372） |
| BYHWD-H | 10 | 18.55±2.882） | 12.29±1.052） | 22.66±2.892） |
| BYHWD-M | 10 | 25.88±3.152） | 15.88±1.292） | 26.98±3.012） |
| BYHWD-L | 10 | 27.61±3.102） | 17.10±1.142） | 28.85±2.292） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. OAS group. | ||||
2.6 BYHWD对OAS大鼠睾丸组织TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的影响
与control组相比，OAS组大鼠睾丸组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达均显著升高（P < 0.05）。与OAS组相比，各BYHWD干预组大鼠睾丸组织TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达均显著降低（P < 0.05），见图 2。
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| *P < 0.05 vs. control group; #P < 0.05 vs. OAS group. 图 2 各组大鼠睾丸组织TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达（n = 10） Fig.2 Protein expression of TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway in testicular tissue of rats in each group (n = 10) |
3 讨论
流行病学调查[14]显示，我国男性不育的发病率呈逐年上升趋势；OAS是导致男性不育的重要原因之一，已经严重损害了患者的生活质量。目前，OAS病因及发病机制尚不完全清楚。中医学认为OAS与中医古籍中记载的“精少、精冷、精薄”类似，符合中医“久病入络”，主要病机以肾虚血瘀、肾脏阴阳失衡及精气受损为特征[3]。中药治疗OAS疗效显著，且具有不良反应小、用药成本低及不易耐药等优势；同时，中药治疗时具有多成分、多通路、多靶点等优势。BYHWD为清朝名医家王清任创制，载于《医林改错》，能够益气养肾、活血通络，改善气虚血瘀型精索静脉曲张术后患者睾丸微循环及精液质量[7]。本研究通过腺嘌呤灌胃法构建OAS大鼠模型，探究BYHWD对OAS大鼠生殖功能的影响。结果显示，BYHWD能够提高OAS大鼠精子计数和活力。性腺和性器官正常发育是维持男性第二性特征的关键，同时也是性功能正常的表现[15]。研究[16]显示，生殖器官（睾丸、附睾等）出现萎缩或是结构出现损伤时会导致性激素分泌异常，诱发性功能障碍。本研究结果显示，与control组相比，OAS组大鼠睾丸组织出现明显的病理性损伤，血清T和E2水平明显降低，FSH、LH、PRL水平明显升高。与OAS组相比，各BYHWD干预组大鼠睾丸组织病理性损伤明显减轻，血清T和E2水平明显升高，FSH、LH、PRL水平明显降低，表明BYHWD具有改善OAS大鼠生精功能和睾丸损伤作用。
锌是体内的微量元素，可以作为辅助因子维持机体的氧化还原平衡[17]。研究[18]显示，缺锌能够抑制机体抗氧化蛋白表达，诱发氧化应激反应；而补锌能够明显抑制氧化应激水平，改善生殖功能损伤。此外，锌还可以与相关蛋白结合参与睾酮合成的调节，缺锌喂养的小鼠睾丸间质细胞中锌水平降低，进而导致睾酮合成相关酶活性降低，从而降低了血清睾酮水平[19]。多项研究[20-22]表明，锌对多种含锌酶结构功能具有重要的调控作用。ALP是反应睾丸功能的标志酶，参与生精细胞分裂增殖。ADH是一种含锌金属蛋白酶，其活性水平与体内锌浓度密切相关。LDH位于睾丸生精细胞的线粒体上，参与生精细胞的能量代谢。这3种含锌酶活性对于维持生精细胞功能具有重要作用。因此，通过调控锌水平对于改善OAS生殖功能具有重要意义。本研究结果显示，与OAS组相比，BYHWD能够提高锌含量，增强含锌酶ADH、ALP、LDH活性。炎症反应与男性不育密切相关，炎性细胞因子参与了生精微环境的调节，能够直接影响精子的形成以及生精细胞的存活[9]。此外，炎症反应还参与了睾丸性不育的发病过程，受损的生精细胞能够进一步诱发细胞相关TLR通路，促进炎症反应，进而加重生精细胞损伤，导致睾丸生精功能障碍[23]。TLR4是诱发一系列免疫炎症反应的关键，MyD88是该信号通路中下游主要接头蛋白，是介导下游炎症反应的关键[24]。MyD88与TLR4受体结合后可以通过IRAK和TRAF6向下游传递信号，最终活化NF-κB通路，促进炎症反应的发生[25]。因此，调控TLR4/MyD88/NF-κB信号通路介导的炎症反应可能对于改善OAS具有重要作用。本研究结果显示，与control组相比，OAS组大鼠睾丸组织炎性细胞因子水平及TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白表达均显著升高。与OAS组相比，BYHWD降低了睾丸组织炎性细胞因子水平，抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白的表达。
综上所述，BYHWD能够改善OAS大鼠的生殖功能，其作用机制可能与调节锌稳态和TLR4/MyD88/NF-κB信号通路，降低炎症反应有关。本研究初步揭示了BYHWD在治疗OAS中可能的分子机制。但是，本研究还存在一定的局限性，未设置TLR4抑制剂TAK-242（干预对照）对OAS大鼠生殖功能的影响。因此，今后将通过对OAS大鼠腹腔注射TAK-242来进一步验证TLR4/MyD88/NF-κB信号通路在BYHWD改善OAS大鼠生殖功能中的作用。
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