2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）主要是由于胰岛素产生不足和（或）胰岛素受体不敏感，致使葡萄糖无法进入细胞^[1]。糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是T2DM最常见的并发症之一，严重威胁患者的健康^[2]。营养干预在防治T2DM的发生发展中具有重要作用^[3-4]。姜黄素（curcumin，CUR）可通过抑制炎症和糖尿病肾损伤，预防DN恶化^[5-7]。四氢姜黄素（tetrahydrocurcumin，THC）是CUR在体内代谢过程中产生的最为活跃和主要的代谢产物，比CUR具有更高的生物利用度、稳定性及生理活性^[8]。本研究探讨了THC对T2DM小鼠体重、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、肾组织病理改变和脂质沉积的影响，并利用转录组测序技术筛选出具有显著差异调控的关键信号通路以及差异表达基因，从营养膳食的角度为THC改善T2DM小鼠肾损伤的效应及其可能的分子机制提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器

THC（上海麦克林生化科技股份有限公司）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，北京索莱宝科技有限公司）；油红O染液、HE染液（武汉赛维尔生物科技有限公司）。血糖仪（安稳+，三诺生物传感股份有限公司）。

1.1.2 实验动物

7周龄雄性C57BL/6J小鼠30只，体重（20±2.5）g，购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司，饲养于大理大学SPF级实验动物房内，明暗12 h交替，温度22~24 ℃，相对湿度40%~70%，小鼠可自由饮食水。实验动物使用许可证号：SYXK[滇] 2018-0002。本研究获得大理大学动物伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 T2DM小鼠模型建立及分组

小鼠适应性饲养1周后，随机分为对照组、T2DM组和T2DM+THC组，每组10只。对照组给予普通饲料（含10% fat kcal%），其余2组均给予高脂饲料（含45% fat kcal%）。喂养8周后，禁食（不禁水）12 h，T2DM组、T2DM+THC组小鼠每周腹腔注射1次STZ（STZ溶于0.1 mol/L的柠檬酸钠缓冲溶液，pH4.5，80 mg/kg），对照组小鼠腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲溶液。连续注射4周，其间对照组给予普通饲料喂养，T2DM组给予高脂饲料喂养，T2DM+THC组在造模的4周期间给予添加了THC的高脂饲料（800 mg/kg饲料）。在造模的第9~12周，每周监测小鼠的体重及FBG。FBG检测方法如下：隔夜禁食（不禁水）12 h后，取小鼠尾静脉血，用血糖仪检测FBG，FBG值≥11.1 mmol/L定义为T2DM。

1.2.2 肾组织HE染色

造模12周后，处死小鼠并取与转录组测序相同编号的小鼠肾组织制作石蜡切片，脱蜡脱水后，用苏木素染液染色3~5 min，梯度乙醇脱水，用伊红染液染色5 min。用无水乙醇脱水15 min，二甲苯脱蜡10 min，中性树胶封片，光学显微镜下采集图像并分析。

1.2.3 肾组织油红O染色

取与转录组测序相同编号的小鼠肾组织制作冰冻切片，室温静置10 min，浸入油红O工作液浸染8~10 min，浸入60%异丙醇分化3~5 s，用纯水浸洗10 s，浸入苏木素染液，对细胞核进行染色，水洗后晾干，封片，光学显微镜下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0软件量化脂滴阳性面积。

1.2.4 肾脏转录组测序及分析

每组取3只小鼠的肾组织，用TRIzol法提取RNA。采用Illumina Hiseq测序平台对样本进行高通量测序（由武汉赛维尔生物科技有限公司完成）。利用hisat2 v2.0.5软件将测序数据与参考基因组mus_musculus_GRCm39_release106进行比对注释，使用DESeq2 v1.20.0软件，以|log₂ FC| ≥1与P < 0.05为显著差异表达的阈值，筛选出差异基因，根据结果进一步进行基因本体（gene ontology，GO）与京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.2.5 双向调控基因筛选及蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建

在Gene Cards数据库（https://www.genecards.org/）输入“type 2 diabetes mellitus”关键词，搜索相关基因，与筛选出的双向调控基因取交集，导入STRING数据库（https://www.cn.string-db.org/），以minimum required interaction score > 0.4为条件，将结果导入Cytoscape软件构建PPI网络。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，用GraphPad Prism 9.4.1统计软件作图，实验数据以x±s表示。组间比较采用单因素方差分析，差异显著后采用Tukey法进行组间的两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 THC对小鼠体重和FBG的影响

T2DM造模结束后，与对照组小鼠相比，T2DM组小鼠出现多饮、多食、多尿，毛色晦暗，逐渐消瘦，体重下降明显；而T2DM+THC组小鼠较T2DM组体重下降缓慢，且在造模后第3、4周时体重有统计学差异（P < 0.05）。高脂饲养联合STZ诱导的T2DM组小鼠FBG逐渐增加，在造模后第3、4周，T2DM组小鼠FBG高于对照组小鼠（P < 0.001），THC干预后，T2DM+THC组小鼠FBG上升缓慢，且在干预第3、4周时FBG低于T2DM组小鼠（P < 0.001），说明膳食补充THC可改善T2DM小鼠的FBG水平。见表 1。

2.2 THC对小鼠肾组织病理的影响

HE染色结果显示，对照组小鼠肾小球和肾小管结构清晰；T2DM组小鼠肾组织出现肾小管空泡变性、肾小球变大、上皮细胞排列紊乱；与T2DM组比较，THC组小鼠肾损伤有不同程度的改善。提示膳食补充THC可改善T2DM小鼠肾损伤。见图 1。

2.3 THC对小鼠肾组织脂质沉积的影响

油红O染色结果显示，对照组小鼠肾组织内几乎无脂滴（1.00±0.50），T2DM组小鼠肾组织内脂滴面积增加（25.39±1.73，P < 0.001），T2DM+THC组小鼠肾组织内脂滴面积则较T2DM组减少（2.16±0.63，P < 0.001）。提示膳食补充THC可显著改善T2DM小鼠肾组织脂质沉积。见图 2。

2.4 小鼠肾脏转录组学分析结果

2.4.1 差异表达基因层次聚类分析

对各组测序数据进行对比分析，以|log₂FC|≥1且P < 0.05筛选出具有统计学意义的差异表达基因，差异表达基因的层次聚类分析结果显示，对照组与T2DM组比较、T2DM组与T2DM+THC组比较，在转录组表达水平上有显著差异（红色为上调基因，绿色为下调基因）。见图 3。

2.4.2 差异表达基因分析

火山图结果显示，与对照组比较，T2DM组共有1 191个差异表达基因，其中包括770个上调基因和421个下调基因；与T2DM组比较，T2DM+THC组共有222个差异表达基因，其中包括75个上调基因和147个下调基因。见图 4。

2.4.3 差异表达基因的GO与KEGG富集分析

GO富集分析显示，差异表达基因主要分布于染色体分离、核分裂、脂肪酸代谢等过程。差异表达基因的KEGG通路富集分析显示，T2DM组较对照组下调的差异表达基因主要涉及PPAR信号通路、脂肪酸降解、视黄醇代谢、脂肪酸代谢等，上调的差异基因主要涉及细胞周期、P53信号通路、补体和凝血级联、吞噬细胞等。T2DM+THC组较T2DM组下调的差异基因涉及的通路主要有P53信号通路、细胞周期、运动蛋白、补体和凝血级联等，上调的差异基因涉及的通路主要有PPAR信号通路、视黄醇代谢、胆汁分泌、胰岛素信号通路等。综上筛选双向调控通路，提示细胞周期（凋亡）、P53信号通路及PPAR信号通路可能在THC改善T2DM肾损伤中发挥主要作用。

2.4.4 双向调控基因筛选

通过对差异表达基因的分析，筛选出同时满足T2DM组较对照组下调而T2DM+THC组较T2DM组上调的差异表达最为显著的基因共计4个（Cd36、Lpl、Pparg和Plin4），同时满足T2DM组较对照组上调而T2DM+THC组较T2DM组下调的差异表达最为显著的基因共计5个（Ccnb1、Ccnb2、Cdk1、Bub1和Cdc25c）。

2.4.5 差异表达基因相互作用分析

将上述9个差异表达基因导入STRING数据库获得PPI网络，并导入Cytoscape软件进行可视化分析。结果显示，Cd36、Lpl、Plin4与Pparg（PPARγ）之间有相互作用关系，均富集于PPAR信号通路；Ccnb1、Ccnb2、Cdk1、Bub1和Cdc25c之间有相互作用关系，均富集于细胞周期调控和P53信号通路。见图 5。

3 讨论

DN是糖尿病常见的微血管并发症，是导致终末期肾脏疾病的主要原因^[9]。营养干预被认为是预防和控制糖尿病及DN发生发展的重要途径之一。CUR的药理学应用由于其全身生物利用度差而受到限制，而THC作为植物多酚CUR的主要肠道代谢产物，比CUR具有更高的生物利用度和稳定性，因此THC在改善慢性代谢性疾病方面具有很大的潜力^[10]。

本研究发现，THC可显著改善T2DM小鼠FBG、肾组织病理改变和肾脂质沉积，可能与改善细胞周期（凋亡）、下调P53信号通路及激活PPARγ信号通路有关。本研究通过对肾组织差异表达基因的KEGG通路富集分析，提示PPAR介导的信号通路富集最多，THC干预可上调T2DM小鼠PPAR信号通路。研究^{[9, 11]}证明，糖尿病导致的肾脏脂质沉积是引起DN和慢性肾损伤的重要机制。调控糖尿病肾脂质沉积的分子机制错综复杂，PPAR介导的信号通路在其中发挥关键作用，可调节脂肪的合成和脂质氧化等多种脂质代谢途径^[12-14]。PPAR是核激素受体家族中的配体激活受体，目前共发现PPARα、PPARδ和PPARγ 3种亚型，其中PPARγ的激活有利于减缓糖尿病的发生、发展，与其调控脂肪前体细胞的分化和脂肪氧化过程参与脂质代谢密切相关，因此PPARγ在T2DM等代谢性疾病及其并发症的防治中起关键作用^[13-14]。本研究通过筛选相关差异表达基因发现，与对照组小鼠比较，T2DM组小鼠肾组织中PPARγ基因表达下调，而THC干预可拮抗上述改变，提示PPARγ及其介导的信号通路可能是THC改善T2DM肾损伤的重要机制，但其具体分子机制需要进一步验证。

本研究还发现，Cd36、Lpl和Plin4基因在T2DM组小鼠肾组织中表达下调，而THC干预可上调以上基因的表达，提示这些基因在THC保护糖尿病肾损伤中可能发挥重要作用。Cd36是一种脂肪酸转运蛋白，是清道夫受体家族的重要成员，在肾脏脂质和能量代谢重编程、细胞凋亡和肾脏纤维化等方面发挥重要作用^[15]。在C57BL/6 J小鼠中，Lpl基因主要在细胞内表达，并局限于肾近端小管^[16]。在DN小鼠中，肾脏Lpl mRNA表达降低与肾组织中甘油三酯水平增高密切相关^[17]。Plin4属于PLIN家族成员，具有1个11聚体重复序列，从而利于其靶向脂滴表面，能保护脂滴免受脂解，但其在糖尿病肾损伤中调控脂质代谢的分子机制仍不明确^[18]。研究^[19-21]发现，PPARγ可通过调控Cd36、Lpl和Plin4基因参与脂质代谢。本研究利用STRING数据库和Cytoscape软件构建的PPI网络图，发现PPARγ、CD36、Lpl和Plin4蛋白之间存在相互作用关系，但THC干预调控PPARγ、Cd36、Lpl和Plin4基因及其蛋白表达的具体机制仍需进一步深入探讨。

P53可调控DN中肾小管细胞自噬和肾纤维化^[22-23]。本研究通过肾组织差异表达基因的KEGG通路富集分析发现，THC干预可下调糖尿病肾组织P53介导的信号通路，富集在P53信号通路的差异表达基因为Ccnb1、Ccnb2和Cdk1。此外，P53信号通路还参与调控肾小管细胞DNA损伤、细胞周期和细胞凋亡^[24]。本研究发现，富集在细胞周期调控的基因为Ccnb1、Ccnb2、Cdk1、Bub1和Cdc25c，Ccnb1、Ccnb2、Cdk1、Bub1和Cdc25c蛋白之间存在PPI网络，主要参与调控细胞周期有丝分裂的G₂/M期。糖尿病可引起肾小管上皮细胞DNA损伤，导致细胞周期失调，进而激活P53信号通路，启动细胞增殖和分化，修复肾损伤，然而在糖尿病的长期病程中，P53信号通路的激活可导致肾小管上皮细胞凋亡和肾纤维化^[25]。P53信号通路还参与调控高脂血症诱导的肾组织脂质代谢^[26]，PPARγ通过调控P53信号通路参与败血症肾损伤^[27]。

综上所述，本研究从营养膳食角度为THC防治糖尿病肾损伤提供了重要的理论基础。今后将进一步通过实验验证转录组测序分析结果的关键靶点及信号通路，更深入地阐明膳食补充THC改善T2DM肾损伤的分子机制。