肺癌的发病率和死亡率目前居全球首位。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占所有肺癌的85%，肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）和肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是NSCLC的2种主要亚型。免疫治疗和靶向治疗是LUAD的主要治疗方法^[1-2]，而约占NSCLC30%的LUSC目前却仍缺乏有效的治疗方法，且缺少预测性生物标志物。大多LUSC患者确诊较晚，预后较差^[3]。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）是肿瘤微环境中含量最高的免疫细胞群，在调节肿瘤进展和治疗耐药性方面起关键作用^[4]。TAM能够促进肿瘤生长、血管生成、基质重塑及肿瘤细胞侵袭和迁移^[5]。TAM与LUSC的关系尚未明确，因此，本研究构建了用于预测LUSC预后的巨噬细胞基因风险评分模型，探讨了巨噬细胞对LUSC生存期的影响，以期为LUSC患者开发有效的预测性生物标志物。

1 材料与方法 1.1 数据收集和整理

由癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库（https://gdc.cancer.gov/）下载501例LUSC患者和49例正常对照者的RNA测序表达谱和相应的临床信息。从中提取TPM格式数据，进行归一化处理log₂（TPM+1），最终保留具有RNAseq数据和临床信息的样本。使用R软件“edgeR”包进行差异表达基因（differential expressed gene，DEG）分析，以P < 0.05和|log₂ FC| > 1作为阈值^[6]。为了研究LUSC中巨噬细胞相关的生物学特征，以“巨噬细胞”为关键词，C5-Gene Ontology作为过滤条件，检索分子特征数据库（The Molecular Signatures Database，MSigDB，https://www.gseamsigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp），收集了40个巨噬细胞相关基因（macrophage associated gene，MAG）集，共包含284个MAG ^[7]。

从TIMER2.0数据库（http://timer.cistrome.org/infiltrationestimatefortcga.csv.gz）基因表达谱中下载22个浸润免疫细胞的绝对分数^[8]。从TCGA得到LUSC患者体细胞突变信息库。使用R软件“maftools”包计算每个样本的体细胞非同义点突变数^[9]。使用在线Venn工具（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制可视化Venn图。为了更好地了解基因的致癌作用，利用R软件“ClusterProfiler”包对交集基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）功能、京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析^[10]。

1.2 风险评分模型构建与评估

采用单因素Cox回归分析探讨交集基因对LUSC患者生存率的影响，进一步使用多因素Cox回归分析缩小候选基因的范围，以构建最优风险模型。最终计算每位患者的风险评分。风险评分=$\sum\nolimits_{n=1}^2 \beta \mathrm{i} \times \mathrm{Ei}$，其中βi为风险系数，Ei为各基因的表达量。根据风险评分中位数将LUSC患者分为低风险组和高风险组。采用Kaplan-Meier生存分析“survival”和“survminer”包，探讨生存时间与风险评分之间的相关性。采用“ggplot2”软件包进行主成分分析（principal component analysis，PCA）^[11]，对不同风险组的分离模式进行可视化。

1.3 风险评分模型评估

通过单因素和多因素Cox回归分析预后信息，并基于Kaplan-Meier生存分析方法分析风险评分与生存时间的关系，绘制生存曲线。采用R软件“time-ROC”包进行受试者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评估模型的特异度和灵敏度^[12]。

1.4 免疫分析

使用CIBERSORT算法计算LUSC患者免疫相关细胞的富集分数，比较高、低风险组22种免疫细胞浸润水平的差异；采用Wilcoxon秩和检验计算2组间肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）的差异；使用“oncoppredict”包进行药敏预测^[13]。为了验证模型的预后价值，用IMvigor210模型进行评估，IMvigor210数据通过R软件“Core Biologies”包下载。分析风险评分与免疫调节剂和免疫细胞之间的关系，通过文献检索，筛选出47个基因作为免疫检查点相关转录本，利用R软件“ggplot2”包提取其表达值并进行分析^[14]。

2 结果 2.1 DEG鉴定和基因集富集分析

对原始数据集进行预处理后，在TCGA-LUSC数据集中，LUSC组与对照组间共发现11 313个DEG。其中，6 979个基因表达上调，4 338个基因表达下调。使用Venn工具鉴定出DEG和MAG之间存在124个交集基因（图 1）。KEGG和GO富集分析表明，这些DEG参与细胞周期、含胶原的细胞外基质、细胞衰老等多种生物学途径；KEGG和GO富集分析表明，这些交集基因参与炎症反应、蛋白结合、癌症途径、细胞因子与细胞因子受体结合等多种生物学途径（图 2）。

2.2 预后模型的构建与评估（图 3）

采用单因素Cox回归对交集基因进行筛选，共有17个基因为与总生存期相关的基因。通过多因素Cox回归分析构建基于交集基因的风险评分模型。该模型可输出每位患者的风险评分，计算公式如下：风险评分=-0.007 8×EDN2+0.167 9×CSF2。根据上述公式计算的中位风险评分，将LUSC患者分为高风险组和低风险组，比较不同风险评分值的LUSC患者的总生存率，结果显示，高风险组患者的生存率低于低风险组患者，LUSC患者的死亡率随着风险评分的降低而降低，CSF2和EDN2对总生存期有显著影响。该模型还可提供有价值的分类评估工具，有助于临床治疗决策。另外，该模型还能利用PCA对不同风险组的分离模式进行可视化分析。

对临床信息进行单因素和多因素Cox回归分析，以确定风险评分是否为独立的预后影响因素。单因素Cox回归分析显示，与其他特征相比，风险评分是一个危险因素（HR=2.689，95%CI：1.298~8.832，P = 0.008）。在校正其他混杂因素后，多因素分析还表明风险评分仍然是LUSC患者的独立预后因素（HR=2.586，95%CI：1.250~5.348，P = 0.010）。

2.3 基于模型基因的肿瘤微环境剖析

使用CIBERSORT算法计算免疫相关细胞的富集分数，结果（图 4A）显示，高风险组患者免疫评分高于低风险组患者，免疫细胞浸润明显增加。低风险组患者CD8效应B细胞和活化的肥大细胞富集。相反，静息记忆CD4⁺T细胞在高风险组患者中富集。模型基因与免疫评分的相关性分析显示，CSF2与B细胞显著相关，END2与骨髓树突状细胞显著相关（图 4B）。除VTCN1外，高风险组免疫检查点基因的表达均高于低风险组（图 4C）。

基于风险评分定量分析高、低风险组的TMB值，结果显示，TMB在高、低风险组间无显著差异（P = 0.14），且与风险评分呈负相关（图 4D、4E）。但高TMB患者表现出令人满意的生存获益（图 4F）。

生存曲线分析结果表明，低风险评分和高TMB与较长的生存期相关（图 4G）。高风险组和低风险组对CTLA4和PDL1免疫治疗的反应无显著差异（图 5A~5D）。进一步分析抗癌药物敏感性和风险评分之间的联系，结果显示，鲁索利替尼、长春瑞滨、紫杉醇和索拉非尼在低风险组的半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC₅₀）值较低，且与风险评分呈正相关（图 5E~5G），提示这些药物在低风险评分的LUSC患者中可能疗效更好。

为了验证模型的预后价值，使用了IMvigor210模型进行评估，结果发现大多数低表达水平免疫检查点相关基因与低风险评分组的最佳生存预期相关，但除CD274、HHLA、NRP1、TNFRSF8外，其表达水平降低在高风险组和不良结局之间显著相关。

3 讨论

巨噬细胞与恶性肿瘤的发展和转移有关^[5]。本研究创建了1个包含2个MAG（CSF2、END2）的风险预后模型，该模型具有较高的灵敏度和特异度（1、3、5年ROC曲线AUC分别为0.570、0.578、0.580），可预测LUSC患者的总生存率。CSF2参与NSCLC细胞自分泌调节^[15]，其上调可诱导间充质干细胞向促癌表型转变，从而促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭^[16]；在适当的刺激下，CSF2可由多种非免疫细胞分泌，并以自分泌或旁分泌方式调节肿瘤细胞（如人黑色素瘤、皮肤癌和结直肠癌）的生长、侵袭和迁移^[17-19]。END2能与ETAR和ETBR受体结合^[20]，激活核因子κB、表皮生长因子受体、血管上皮生长因子受体通路，而这些信号通路在肿瘤的发生、发展中起核心作用^[21-23]。

肿瘤细胞能够通过肿瘤微环境逃避免疫监视和药物干扰^[24]。肿瘤微环境通过抑制免疫系统靶向肿瘤细胞的能力，促进肿瘤细胞存活。研究^[25]表明，高危人群免疫检查点和抗肿瘤浸润性免疫细胞的表达水平降低，免疫功能普遍受损。本研究结果发现，LUSC可通过抑制免疫系统靶向肿瘤细胞的能力支持肿瘤微环境，促进肿瘤细胞存活。本研究结果表明，风险评分与活化的肥大细胞的富集呈负相关，LUSC肿瘤内肥大细胞密度升高与微血管密度正相关，且肿瘤内肥大细胞密度高的患者总生存期延长；而现有的部分研究^[26]显示肥大细胞浸润与NSCLC不良预后相关，可能与促血管生成因子释放有关。静息记忆CD4⁺T细胞是适应性免疫的重要组成部分，具有长寿命、低分化和高反应性特征^[27]，本研究发现，风险评分与静息记忆CD4⁺T细胞的富集呈正相关。然而，肿瘤异质性和免疫抑制微环境限制了现有治疗方法的普适性，仅少数小细胞肺癌患者因ZFHX3突变表现出高免疫浸润，可能从免疫治疗中获益。此外，本研究还发现，高风险组患者对鲁索利替尼、长春瑞滨、紫杉醇和索拉非尼的IC₅₀值较高，这可能是高风险组患者对LUSC化疗药物有耐药性且预后不良的原因。

本研究建立的风险评分模型表现良好，但仍有需改进之处：回顾性招募患者可能存在一定程度的偏差；缺乏对LUSC细胞中EDN2生物学功能的深入研究，有待进一步的实验研究；需要大样本、高质量、全面的后续多中心随机对照试验进一步确认。

综上所述，本研究成功筛选出2个与LUSC预后密切相关的基因CSF2和END2，并构建了巨噬细胞相关的风险评分模型，利用该模型可有效预测LUSC患者的总体生存期，也可有效预测患者的免疫状态，为LUSC的分子靶向治疗提供了新的潜在靶点。