临床上男性生育力评估的基本依据是精液常规分析，但是仅根据精子的显微细胞特征评估其质量，提供的男性生育力信息有限，且不能完全解释男性不育的原因^[1]。近年来，随着流式细胞术检测技术的逐渐成熟，以吖啶橙（acridine orange，AO）作为染料的精子染色质结构分析（sperm chromatin structure assay，SCSA）^[2-3]技术已经广泛用于不育和接受辅助生殖的患者^[4]。SCSA主要用于检测精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）和精子高DNA可染性（high DNA stainability，HDS）。DFI已被广泛用于男性生殖领域。HDS作为检测染色质结构异常的另一项指标，人们对其临床应用价值仍存在不同意见^[5-6]。本研究通过分析HDS与精液常规参数的相关性，探索其在男性生育力评估中的价值，为男性不育的进一步临床治疗提供更多的理论依据。

1 材料与方法 1.1 研究对象和分组

收集2024年9月至10月于我院生殖医学科男科门诊就诊的396例育龄男性的精液标本。396例受试者平均年龄（32.1±5.2）岁；其中，精子形态学参数异常（畸形精子症）244例，精子数量参数异常68例，精子活力参数异常112例，精液各项参数均正常121例。

将244例畸形精子症患者按精子畸形程度分为极重度畸形精子症组（35例，14.3%）、重度畸形精子症组（56例，23.0%）、中度畸形精子症组（61例，25.0%）和轻度畸形精子症组（92例，37.7%）。

纳入标准：年龄＜50岁；近3个月内未接受任何与生育有关的药物治疗。排除标准：无精子症患者；白细胞精子症患者；精液液化障碍及黏稠度异常患者；染色体结构异常者；隐睾症患者；有生殖系统恶性肿瘤病史者；有放疗史或化疗史者；有睾丸外伤、扭转或萎缩史者；有腮腺炎性睾丸炎史者；近期有病毒感染者；近期有发热者；患有全身和内分泌疾病者。本研究经中国人民解放军北部战区总医院伦理委员会批准。

1.2 精液参数检测和评估

精子质量评估根据世界卫生组织《人类精液检查与处理实验手册》第5版标准。

1.2.1 精液标本收集

禁欲2~7 d，手淫取精，避免污染。

1.2.2 精液常规参数检测

精液标本置于无菌容器中，放入37℃恒温箱水浴30~60 min，精液液化完全后，采用Hamilton Thorne IVOS Ⅱ全自动精子分析仪（美国Hamilton Thorne公司）进行计算机辅助精子分析，分析精子总数、精子浓度、前向运动精子百分率。巴氏染色法制备精液涂片后，采用SAS-D6全自动精子质量分析仪[赛司医疗科技（北京）有限公司]识别每个异常形态精子，并辅助人工校对。计算正常形态精子百分率（normal sperm morphology rate，NSMR）、精子头部畸形比例、精子中段畸形比例、精子尾部畸形比例、畸形精子指数（teratozoospermia index，TZI）、多重异常指数（multiple anomalies index，MAI）和精子畸形指数（sperm deformity index，SDI）。其中，TZI=所有异常精子类型的总数/异常精子总数，MAI为每个异常精子的缺陷平均数，SDI=精子缺陷总数/精子总数。

1.2.3 精子染色质结构检测

根据文献[2]进行精液样本处理和染色，采用低pH值的活性剂溶液处理精液样本，使精子染色质变性，中和样本悬液后用含有AO的溶液染色。采用LongCyte C2060型流式细胞仪（北京层浪生物科技有限公司）收集处理后的样本，计算HDS和DFI。

1.2.4 畸形精子症分度标准

（1）极重度畸形精子症，NSMR＜1%；（2）重度畸形精子症，NSMR1%~＜2%；（3）中度畸形精子症，NSMR2%~＜3%；（4）轻度畸形精子症，NSMR3%~＜4%。NSMR≥4%为正常。

1.3 统计学分析

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。采用Pearson相关性分析评估精液常规参数与HDS、DFI、年龄的相关性。使用前向多元线性回归分析识别与HDS显著相关的自变量。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 典型高HDS流式细胞精子染色质结构分析图

图 1为SCSA技术检测1例不育男性患者的精子染色质结构图。精子细胞核染色质经酸变性后进行AO染色，通过流式细胞仪分出3个明显不同的群：正常精子染色质结构群（G）；高HDS群（G1），HDS测值为40.43%；DNA碎片群（G2），DFI测值为5.46%。

2.2 HDS、DFI与精液常规参数、年龄的相关性

396例受试者中，HDS与精子总数、精子浓度、前向运动精子百分率、NSMR均呈显著负相关（P＜0.01）；DFI与前向运动精子百分率、NSMR呈显著负相关（P＜0.01），与年龄呈显著正相关（P＜0.05）。见表 1。

2.3 影响HDS的精液常规参数的多元线性回归分析

在调整混杂因素（包括精子总数、精子浓度、前向运动精子百分率、NSMR、DFI）后，396例受试者中前向运动精子百分率、NSMR、DFI对HDS存在显著负性影响（P＜0.05）。其中，NSMR对于HDS的影响程度最大，DFI其次。见表 2。

2.4 畸形精子症患者中HDS、DFI与精液常规参数、年龄的相关性

244例畸形精子症患者中，HDS与NSMR呈显著负相关（P＜0.01），与精子头部和尾部畸形比例呈显著正相关（P＜0.05）；DFI与精子尾部畸形比例呈显著正相关（P＜0.01）。见表 3。

2.5 不同程度畸形精子症患者间HDS、DFI和精液常规参数的比较

极重度、重度、中度、轻度畸形精子症4组患者比较，精子头部畸形比例、精子尾部畸形比例、SDI、MAI、HDS的差异均有统计学意义（均P＜0.05）。4组间两两比较，精子头部畸形比例的差异有统计学意义（P＜0.001），畸形程度越重，精子头部畸形比例越高。极重度、重度组精子尾部畸形比例显著高于轻度组（P＜0.05）。极重度、重度组SDI显著高于轻度组（P = 0.001）。极重度组MAI显著高于轻度组（P＜0.05）。极重度组HDS显著高于轻度组和中度组（P＜0.05）。4组间DFI无统计学差异（P > 0.05）。见表 4。

3 讨论

近年来，越来越多的体外和体内研究^[7-8]证实了精子染色质结构在受精、早期胚胎发育、胚胎植入和妊娠中的重要性。EVENSON等^{[3, 9]}应用SCSA检测精子的染色质结构，这是基于AO分子穿透致密的精子染色质来实现的，可以作为精液常规检查的重要补充。AO与精子DNA单链或双链断裂部位结合呈现红色荧光，与无断裂的精子DNA结合呈现绿色荧光。在精子细胞逐渐成熟至精子的过程中，当精子组蛋白与鱼精蛋白转换异常时，精子组蛋白比例越高，精子染色质致密化程度越低，暴露的DNA与AO结合产生的绿色荧光越强，代表精子核成熟度越低^[3]。

本研究结果显示，HDS与精子总数、精子浓度、前向运动精子百分率、NSMR呈显著负相关。近年来，刘星池等^[10]通过回顾性研究发现HDS与精子运动参数相关。刘贞辉等^[11]、丁旭锋等^[12]的研究也得出与本研究大体一致的结果。为了进一步了解精液相关参数对HDS的影响程度，本研究在调整精子总数、精子浓度、前向运动精子百分率、NSMR、DFI、年龄这些因素后，发现NSMR对HDS存在最显著的负性影响，DFI次之。有研究^[8]对1 393例不育男性的精液样本进行检查，发现畸形精子百分率增高与精子HDS增加有关，从另一个角度验证了本研究结果。

畸形精子症是导致男性不育的常见原因之一。精子按畸形部位不同，可以分为头部畸形、中段畸形以及尾部畸形。临床上精子的畸形多发生于头部，常见的畸形精子类型包括圆头精子症、大头精子症、无头精子症、无定形头、精子鞭毛多发形态异常等^[13]。本研究中，为了解精子形态与HDS的关系，对精子形态异常的人群单独进行了分析。结果显示，在畸形精子症患者中，HDS与精子头部及尾部畸形比例关系密切，HDS越高，头部与尾部畸形比例越高。而DFI仅与精子尾部畸形比例有关。为了进一步验证HDS与精子头部形态的关系，本研究按精子畸形严重程度，将患者分为极重度、重度、中度、轻度畸形精子症4组。结果显示，4组间精子头部畸形比例存在统计学差异，畸形程度越严重，精子头部畸形比例越高。极重度HDS明显高于轻度组和中度组，4组间DFI无统计学差异。上述研究结果证明，畸形精子症患者精子头部形态异常的原因更多是精子细胞核发育的成熟度异常，而不是DNA碎片增加。

HDS与男性生育能力的关系一直是研究关注的热点问题。NI等^[14]对12项关于精子染色质结构损伤和男性生育力关系的研究进行荟萃分析，结果发现，精子染色质结构损伤与鱼精蛋白缺乏症和男性生育能力下降密切相关。已有大量的人和动物研究^[15-17]证实，鱼精蛋白缺乏和鱼精蛋白巯基氧化不完全都可能导致精子头部形态缺陷，这些结果提示精子染色质致密化可能是精子头部形态的重要决定因素。JERRE等^[5]对1 602例行辅助生殖的男性精液进行研究，发现高HDS很可能对精液质量和辅助生殖结局产生不利影响。范烺等^[18]对行体外受精的不育患者进行研究，结果发现，精子HDS可能是导致精子DFI增高、精子畸形的风险指标。精子头部承载着遗传物质，并负责与卵子结合。本研究结果证实了高HDS与精子头部畸形严重程度紧密相关，为高HDS导致男性生育力下降和辅助生殖的不良结局提供了有力的临床证据。

综上所述，HDS作为反映精子染色质结构异常的重要指标，与精子常规参数关系密切。畸形精子症患者中精子头部畸形比例与HDS关系最为密切，但与DFI无关。HDS很可能是反映精子质量尤其是精子头部畸形程度的一项重要标志物。因此，应进行进一步研究，深入探索HDS在男性生育力评估中的临床意义。