2025, Vol. 54文章信息
- 陈远航, 何朗, 谭卯, 徐毅, 李霞
- CHEN Yuanhang, HE Lang, TAN Mao, XU Yi, LI Xia
- lncRNA FGD5-AS1调节miR-133a-3p/SPAG5轴对胃癌细胞迁移和侵袭的影响
- lncRNA FGD5-AS1 regulates gastric cancer cell migration and invasion via the miR-133a-3p/SPAG5 axis
- 中国医科大学学报, 2025, 54(5): 401-406
- Journal of China Medical University, 2025, 54(5): 401-406
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文章历史
- 收稿日期：2024-09-05
- 网络出版时间：2025-05-20 10:28:25
引用本文 |
2. 成都市第五人民医院胃肠外科，成都 611130
2. Department of Gastrointestinal Surgery, Chengdu Fifth People's Hospital, Chengdu 611130, China
胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，在癌症死亡原因中居第4位[1]，目前主要的治疗方法是手术切除、放疗、化疗以及综合治疗，约5%的患者生存期可达5年，但约有40%的患者发生转移[2-3]。因此，关注胃癌转移的分子机制有利于改善患者的预后。
长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）可作为竞争性内源性RNA吸附微RNA（microRNA，miRNA），从而在肿瘤增殖、侵袭与转移等生物学过程中发挥调节作用[4]。研究[5]发现，lncRNA FGD5-AS1在胃癌中作为致癌因子发挥作用，但其机制尚未明确。生物信息学研究[6]显示，miR-133a-3p可能同时与FGD5-AS1、精子相关抗原5（sperm-associated antigen 5，SPAG5）结合，并参与调节胃癌细胞的增殖和自噬，与胃癌的发生相关。SPAG5是一种参与细胞分裂的纺锤体结构蛋白，其功能障碍或失调与肿瘤相关，SPAG5在胃癌组织中呈高表达[7]。因此，本研究拟探讨lncRNA FGD5-AS1是否通过调节miR-133a-3p/SPAG5轴参与胃癌细胞的迁移和侵袭。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 组织和细胞胃癌组织和邻近非肿瘤组织（距离肿瘤组织5 cm处）取自我院2022年3月至2023年6月31例经病理确诊的胃癌患者的手术切除标本，所有组织冻存在液氮中备用。所有患者术前未接受化疗或放疗。本研究符合《赫尔辛基宣言》标准，并获得我院伦理委员会批准（2023医研伦审第167号）。所有研究对象签署知情同意书。
正常人胃上皮细胞系GES-1及胃癌细胞系（MKN-28、NCI-N87、HGC-27、AGS）由美国细胞培养收藏中心提供。
1.1.2 主要试剂和仪器PrimeScript 1st Strand cDNA合成试剂盒购自日本TaKaRa公司；干扰FGD5-AS1（siFGD5-AS1）、miR-133a-3p抑制剂及模拟物（miR-133a-3p inhibitor、miR-133a-3p mimic）及对应的阴性对照（siNC、inhibitor NC、mimics NC）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；增殖蛋白Ki-67、SPAG5、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9抗体购自英国abcam公司；迁移侵袭增强子因子1（migration and invasion enhancer factor 1，MIEN1）购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司。IX73倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司。
1.2 方法 1.2.1 实时定量PCR用TRIzol试剂提取胃癌组织、邻近非肿瘤组织及GES-1、MKN-28、NCI-N87、HGC-27、AGS细胞RNA，转录成cDNA，用实时定量PCR检测FGD5-AS1、SPAG5 mRNA的表达，以β-actin为内参照；检测miR-133a-3p表达，以U6为内参照。采用2-ΔΔCt法进行定量分析。PCR引物序列：FGD5-AS1，正向5’-AACAGTGCCTATGTGGACGG-3’，反向5’-C CCATCACAGAGGTCCACAC-3’；miR-133a-3p，正向5’-GCCTTTGGTCCCCTTCAAC-3’，反向5’-TATGCT TGTTCTCGTCTCTGTGTC；SPAG5，正向5’-CATCTC ACAGTGGGATAACTAATAAAC-3’，反向5’-CAGGG ATAGGTGAAGCAAGGATA-3’；β-actin，正向5’-CCC TGGAGAAGAGCTACGAG-3’，反向5’-CGTACAGGT CTTTGCGGATG-3’；U6，正向5’-CGCTTCGGCAGCAC ATATAC-3’，反向5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’。
1.2.2 细胞分组及处理选取生长良好的MKN-28细胞进行处理分组。将常规培养的MKN-28细胞设为空白组。利用lipofectamine 2000试剂，分别将siFGD5-AS1、siNC、siFGD5-AS1+miR-133a-3p inhibitor、siFGD5-AS1+inhibitor NC转染至细胞，并设为siFGD5-AS1组、siNC组、siFGD5-AS1+miR-133a-3p inhibitor组、siFGD5-AS1+inhibitor NC组。
1.2.3 EdU染色检测细胞增殖将细胞接种至96孔板中（2×104/孔），室温下，用50 μmol/L EdU处理细胞2 h后，用4%多聚甲醛固定30 min，用0.5% Triton X-100透化10 min。用DAPI复染细胞核。选取5个随机区域，观察染色结果，分析EdU阳性率。
1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖将细胞悬液按2×103/100 μL接种至96孔板中，培养至贴壁后，加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h后，在450 nm处测量吸光度（absorbance，A）值。
1.2.5 Transwell实验检测细胞侵袭将细胞悬液按1×104/孔接种至涂有100 μL基质胶（1 mg/mL）的Transwell上室，弃原始培养基，加入无血清培养基，然后将含有20%血清的500 μL完全培养基作为化学引诱剂加入下室，培养24 h后，取出小室并弃去培养基，棉签刮去附着在上室的残留细胞；用4%多聚甲醛固定下室细胞，结晶紫染色，干燥、拍照，并在5个随机视野中计数侵袭细胞数。
1.2.6 划痕实验检测细胞迁移将细胞接种至6孔板中，待生长融合至80%~90%，用200 μL移液器枪头在培养皿中划痕，用PBS洗3次后，用含2%胎牛血清和双抗体培养基继续培养，拍照并记录0、24 h细胞形态，计算划痕愈合率（%），评估细胞迁移能力。
1.2.7 Western blotting裂解细胞并提取总蛋白，进行12% SDS-PAGE电泳，将蛋白转至PVDF膜，用5%脱脂乳封闭，加入Ki-67（1∶1 000稀释）、MIEN1（1∶2 000稀释）、SPAG5（1∶500稀释）、MMP-9（1∶ 1 000稀释）抗体孵育24 h后，清洗并加入二抗（1∶ 10 000稀释）孵育，通过ImageJ软件观察和分析蛋白条带。
1.2.8 双萤光素酶实验验证miR-133a-3p与FGD5-AS1、SPAG5的靶向关系在pmirGLO载体的参与下构建SPAG5野生型（WT）、FGD5-AS1 WT，在突变SPAG5和miR-133a-3p的结合位点后构建SPAG5突变型（MUT）、FGD5-AS1 MUT。利用lipofectamine 3000试剂，将构建的载体与miR-133a-3p模拟物或阴性对照共转染至细胞中，检测细胞萤光素酶活性。
1.3 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料用x±s表示，采用t检验、单因素方差分析、SNK-q检验比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 细胞及组织中FGD5-AS1、miR-133a-3p、SPAG5 mRNA表达水平胃癌组织中FGD5-AS1和SPAG5 mRNA表达水平（1.58±0.17，1.52±0.16）较邻近非肿瘤组织（0.92±0.11，0.98±0.10）升高，miR-133a-3p表达水平（0.43±0.06）较邻近非肿瘤组织（1.01±0.11）降低；MKN-28和NCI-N87、HGC-27、AGS细胞中FGD5-AS1表达水平（0.64±0.27，1.44±0.15，1.55±0.16，1.75±0.19）较GES-1细胞（1.07±0.11）升高，SPAG5 mRNA表达水平（2.68±0.28，1.42±0.15，1.46±0.15，1.59±0.17）较GES-1细胞（1.01±0.11）也升高，miR-133a-3p表达水平（0.28±0.04，0.71±0.08，0.68±0.07，0.53±0.06）较GES-1细胞（0.98±0.10）降低（P＜0.05），其中MKN-28细胞中表达变化最为显著（P＜0.05），因此选择MKN-28细胞进行后续实验。
2.2 各组MKN-28细胞中FGD5-AS1、miR-133a-3p、SPAG5的表达情况siFGD5-AS1组FGD5-AS1、SPAG5 mRNA表达水平（0.47±0.05，0.58±0.06）较空白组（1.01±0.11，1.03±0.11）、siNC组（0.94±0.10，0.97±0.10）降低，miR-133a-3p表达水平（1.56±0.17）较空白组（0.92±0.10）、siNC组（1.02±0.11）增加（P＜0.05）；siFGD5-AS1+ miR-133a-3p inhibitor组SPAG5 mRNA表达水平（0.89±0.09）较siFGD5-AS1+inhibitor NC组（0.59±0.06）增加，miR-133a-3p表达水平（1.13±0.13）较si FGD5-AS1+inhibitor NC组（1.61±0.17）降低（P＜0.05），提示沉默FGD5-AS1可能影响miR-133a-3p、SPAG5的表达。
2.3 沉默FGD5-AS1对各组MKN-28细胞增殖的影响siFGD5-AS1组较空白组、siNC组A450 nm值（0.51±0.06，1.13±0.10，1.09±0.11）及EdU阳性率（28.18%±0.90%，70.15%±7.10%，69.43%±7.05%）显著降低（P＜0.05）；siFGD5-AS1+miR-133a-3p inhibitor组A450 nm值（0.89±0.09）及EdU阳性率（44.57%±4.50%）较siFGD5-AS1+inhibitor NC组（0.58±0.07，27.86%±2.81%）增加（P＜0.05），提示沉默FGD5-AS1可抑制MKN-28细胞增殖。见图 1。
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| 图 1 MKN-28细胞EdU染色结果 Fig.1 The Edu staining results of MKN-28 cells |
2.4 沉默FGD5-AS1对各组MKN-28细胞侵袭能力的影响
siFGD5-AS1组侵袭细胞数（68.26±7.05）较空白组（125.62±1.05）、siNC组（124.86±1.91）显著降低（P＜0.05）；siFGD5-AS1+miR-133a-3p inhibitor组侵袭细胞数（108.24±11.09）较siFGD5-AS1+inhibitor NC组（68.13±6.97）显著增加（P＜0.05），表明沉默FGD5-AS1可抑制MKN-28细胞侵袭。见图 2。
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| 图 2 各组MKN-28细胞侵袭变化 ×200 Fig.2 Changes of MKN-28 cell invasion in each group ×200 |
2.5 沉默FGD5-AS1对各组MKN-28细胞迁移能力的影响
siFGD5-AS1组划痕愈合率（41.05%±4.21%）较空白组（78.16%±7.98%）、siNC组（78.07%±7.89%）显著降低（P＜0.05）；siFGD5-AS1+miR-133a-3p inhi-bitor组划痕愈合率（68.52%±6.92%）较siFGD5-AS1+inhibitor NC组（40.86%±4.15%）显著增加（P＜0.05），说明沉默FGD5-AS1可抑制MKN-28细胞迁移。见图 3。
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| 图 3 各组MKN-28细胞划痕愈合能力变化 ×100 Fig.3 Changes of MKN-28 cell scratch healing ability in each group ×100 |
2.6 沉默FGD5-AS1对MKN-28细胞Ki-67、MIEN1、SPAG5、MMP-9蛋白表达的影响
siFGD5-AS1组较空白组、siNC组Ki-67、MIEN1、SPAG5、MMP-9蛋白表达水平降低（P＜0.05）；siFGD5-AS1+miR-133a-3p inhibitor组Ki-67、MIEN1、SPAG5、MMP-9蛋白表达水平较siFGD5-AS1+inhibitor NC组显著增加（P＜0.05），说明沉默FGD5-AS1可抑制MKN-28细胞迁移、侵袭及增殖。见图 4。
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| 1, blank group; 2, siNC group; 3, siFGD5-AS1 group; 4, siFGD5-AS1+inhibitor NC group; 5, siFGD5-AS1+miR-133a-3p inhibitor group. *P < 0.05 vs. blank group; #P < 0.05 vs. siNC group; △P < 0.05 vs. siFGD5-AS1+inhibitor NC group. 图 4 细胞中Ki-67、MIEN1、SPAG5、MMP-9蛋白表达的比较 Fig.4 Comparison of Ki-67, MIEN1, SPAG5, and MMP-9 protein expression |
2.7 miR-133a-3p与FGD5-AS1、SPAG5的靶向验证
StarBase显示miR-133a-3p与SPAG5有连续碱基配对。miR-133a-3p mimics和SPAG5 MUT共转染，萤光素酶活性明显降低（P＜0.05）。StarBase显示miR-133a-3p与FGD5-AS1有连续碱基配对。miR-133a-3p mimics和FGD5-AS1 MUT共转染，萤光素酶活性明显降低（P＜0.05），表明miR-133a-3p与FGD5-AS1、SPAG5分别存在靶向关系。见图 5。
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| A, binding sites of miR-133a-3p and SPAG5;B, validation of miR-133a-3p and SPAG5 targeting, * P < 0.05 vs. mimics NC+SPAG5 WT group; C, binding sites of miR-133a-3p and FGD5-AS1;D, targeting validation of miR-133a-3p and FGD5-AS1, # P < 0.05 vs. mimics NC+FGD5-AS1 WT group. 图 5 miR-133a-3p与SPAG5、FGD5-AS1结合位点及靶向验证 Fig.5 Binding sites and targeting validation of miR-133a-3p with SPAG5 and FGD5-AS1 |
3 讨论
胃癌是一种起源于胃组织内的恶性肿瘤，发病率随年龄增长而增加，50岁以上人群及男性患病率更高[8]。胃癌的发病机制尚未完全阐明，但幽门螺杆菌感染、饮食习惯、吸烟等可能是其主要的危险因素。胃癌的治疗方案局限于手术、化疗或放疗，且对转移性胃癌的治疗选择有限[9-10]。
lncRNA是一种新形式的RNA转录物，在多种组织和细胞中，尤其是恶性肿瘤中具有重要意义[11]。FGD5-AS1是一种新发现的lncRNA，已被证明在多种肿瘤中呈过表达，与肿瘤细胞的生长和转移有关[12]。FGD5-AS1在卵巢癌组织和细胞系中表达增加，过表达FGD5-AS1可促进卵巢癌细胞增殖和人脐静脉内皮细胞血管生成，是卵巢癌发生的潜在致癌因子[13]。FENG等[14]研究表明FGD5-AS1在胃癌组织中表达上调，FGD5-AS1高表达水平的胃癌患者发生淋巴转移或远处转移的风险更高、预后更差，提示FGD5-AS1可能参与胃癌的转移和预后。本研究结果显示，FGD5-AS1的表达在胃癌组织及MKN-28和NCI-N87、HGC-27、AGS细胞中均上调，且在MKN-28细胞中变化最为显著，与GAO等[5]的研究结果一致，提示FGD5-AS1可能与胃癌的发生、发展有关。干扰FGD5-AS1表达可显著抑制MKN-28细胞增殖及侵袭、迁移，Western blotting结果显示，干扰FGD5-AS1表达可抑制Ki-67、MIEN1、MMP-9蛋白表达，进一步表明干扰FGD5-AS1表达可能成为治疗胃癌的靶点，但FGD5-AS1在胃癌发生发展中的分子机制仍需探究。
lncRNA可作为内源性海绵调节miRNA的表达和生物学功能。miRNA是一类长度为18~25个核苷酸的非编码RNA，在多种肿瘤的发生和发展过程中起关键的调节作用[15-16]。前期研究依据生物信息学分析确定了FGD5-AS1的可能靶位，推测FGD5-AS1可能通过miR-133a-3p在胃癌中发挥作用，且miR-133a-3p在肿瘤中的存在已被证实，在多种癌症中起肿瘤抑制因子的作用[17]。研究[18]表明，miR-133a-3p过表达可阻断自噬介导的谷氨酰胺分解，抑制胃癌细胞的生长和转移。丁硫氨酸是用于治疗胃癌的药物，其作用机制可能与上调miR-133a-3p有关[19]。本研究结果显示，miR-133a-3p在胃癌组织及MKN-28和NCI-N87、HGC-27、AGS细胞中均下调，FGD5-AS1可靶向负调节miR-133a-3p表达，干扰FGD5-AS1可上调miR-133a-3p表达，进而抑制MKN-28细胞的恶性行为。生物信息学分析还发现，SPAG5与miR-133a-3p有结合位点，SPAG5也与肿瘤发生密切相关，并具有致癌作用[20]。本研究发现，SPAG5在胃癌组织及MKN-28和NCI-N87、HGC-27、AGS细胞中均上调，提示SPAG5在胃癌进展中可能发挥致癌作用[7]。本研究通过双萤光素酶实验验证了SPAG5与miR-133a-3p的靶向关系，干扰FGD5-AS1可上调miR-133a-3p表达，进而下调SPAG5表达，发挥抑制胃癌发展的作用，故推测FGD5-AS1可能通过上调miR-133a-3p/SPAG5轴阻止胃癌的进展。本研究还通过miR-133a-3p inhibitor进行反向验证，结果发现，miR-133a-3p inhibitor逆转了干扰FGD5-AS1对MKN-28细胞恶性发展的抑制作用，表明FGD5-AS1可能通过上调miR-133a-3p/SPAG5轴抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。
综上所述，本研究发现，lncRNA FGD5-AS1可抑制胃癌细胞迁移和侵袭，可能与上调miR-133a-3p/SPAG5轴有关，但因实验细胞单一，缺乏体内研究验证，故具体机制有待进一步研究。
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