绝经后女性体内雌激素水平降低，导致骨吸收增加，骨形成减少，骨平衡破坏，从而诱发绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMO) ^[1]。全球约有10%的人口和超过30%的50岁以上绝经后女性患有骨质疏松症^[2-3]。目前抗PMO的药物以选择性雌激素受体调节剂、降钙素、双膦酸盐类药物为主，但不良反应较多^[4]。目前传统中医药已广泛用于PMO治疗^[5]。骨质疏松症属于中医“骨痿”范畴，“肾虚髓枯”是其最主要病机^[6]。绝经后女性脏腑机能衰退，久病肾阴阳俱虚^[7]。龟鹿二仙胶对肾阴阳两虚型骨质疏松症疗效确切^[8]。

代谢组学是基于高通量化学分析技术对生物体细胞、组织中的代谢产物进行定性和定量的研究^[9]。其中，非靶向代谢组学能全面准确地反映生物体、组织样本中的代谢物信息，有利于挖掘生物样本新的代谢通路等^[10]。超高效液相色谱与高分辨质谱联用，即液质联用技术，广泛应用于非靶向代谢组学研究^[11]。本研究结合非靶向代谢组学技术，深入探讨龟鹿二仙胶防治PMO过程中的药效学机制。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 实验动物

50只7~8周龄SPF级雌性SD大鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司，体重(200±20) g，许可证号: SCXK (辽) 2020-0001。大鼠饲养于辽宁中医药大学动物实验中心，温度22~25 ℃，湿度30%~50%，饲养1周，大鼠饮食水自由。本研究已获得我院实验动物伦理委员会批准[2023CS (DW)-026-01]。

1.1.2 药品和主要试剂

龟鹿二仙胶(龟板489 g、鹿角胶489 g、人参489 g、枸杞733 g)，购自辽宁省沈阳市康多辽河药房。4%多聚甲醛溶液、EDTA脱钙液购自北京索莱宝科技有限公司。

1.1.3 主要设备

电子光学显微镜(ECLIPSE LV150NA，日本Nikon公司); 显微计算机断层扫描(microcomputed tomography，MicroCT) 机(ZKKSMCT-Sharp-Ⅰ，广州中科恺盛医疗科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及处理

将50只大鼠按随机数字法分为假手术(sham) 组、模型(OVX) 组、龟鹿二仙胶低剂量(GLE-L) 组、龟鹿二仙胶中剂量(GLE-M) 组、龟鹿二仙胶高剂量(GLE-H) 组，每组10只。所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥纳溶液(0.1 mL/100 g) 麻醉后，俯卧固定于实验台，消毒，备皮，在股骨近端连线与后正中线交点处，做约2 cm纵行切口，摘除双侧卵巢组织，止血，缝合，消毒。sham组大鼠仅取等量的皮下脂肪组织。大鼠术后观察7 d后，开始每日灌胃给药，持续8周。依据第4版《药理实验方法学》，计算出龟鹿二仙胶给药浓度为1.7 g/mL。OVX组大鼠给予龟鹿二仙胶4.030 g/kg灌胃; GLE-L组大鼠给予龟鹿二仙胶2.015 g/kg灌胃; GLE-M组大鼠给予龟鹿二仙胶4.030 g/kg灌胃; GLE-H组大鼠给予龟鹿二仙胶8.060 g/kg灌胃; sham组大鼠灌胃等体积饮用水。

1.2.2 大鼠血清、骨组织标本收集

实验结束时，大鼠麻醉后经腹主动脉采血，离心取上清液置于EP管中，于-80 ℃冻存。取大鼠两侧股骨，去除附着组织，用生理盐水洗净，外包锡纸，于-80 ℃冻存。

1.2.3 大鼠股骨组织切片制作

用4%多聚甲醛溶液固定骨组织5 d，放入15%乙二胺四乙酸溶液脱钙4周，以大头针可轻松刺入股骨确定脱钙成功，进行石蜡包埋，制作6 μm厚度切片备用。

1.2.4 MicroCT检测骨结构

用4%多聚甲醛溶液固定股骨标本24 h，将标本固定在MicroCT载物台上扫描，角度为360 °，分辨度为10 μm，以股骨近端1.5 mm区域作为感兴趣区域(region of interest，ROI)，建立骨小梁3D图像后进行分析，主要检测参数包括骨体积、骨密度、皮质骨体积、皮质骨厚度、骨小梁体积、骨小梁厚度。

1.2.5 骨组织免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC) 染色

骨组织切片脱蜡，抗原修复，血清封闭，一抗孵育过夜，二抗标记，DAB显色。显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，苏木素复染，固定封片，检测。

1.2.6 Western blotting检测相关蛋白表达

提取骨组织蛋白，上样电泳，转膜，封闭，一抗孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗孵育，ECL发光成像，使用Image J软件测定各蛋白条带平均灰度值。

1.2.7 非靶向代谢组学检测

将冻存的大鼠血清标本送至北京诺禾致源科技股份有限公司，应用液质联用技术进行非靶向代谢组学检测分析。鉴定结果采用主成分分析(principal component analysis，PCA)，对差异代谢物进行筛选与鉴定，对差异代谢物通路等进行综合分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料用x±s表示，2组间比较用t检验，多组间比较采用方差分析方法。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MicroCT检测结果

结果显示，与sham组较，OVX组、GLE-H组、GLE-M组、GLE-L组骨组织骨体积、骨密度、骨小梁连接密度、骨小梁数均显著减低，差异有统计学意义(P < 0.05)。与OVX组比较，GLE-H组、GLE-M组、GLE-L组上述指标显著增高，差异有统计学意义(P < 0.05)，其中GLE-M组效果最显著，而GLE-H与GLE-L组效果次之。各组皮质骨厚度比较差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 1。

2.2 IHC染色结果分析

结合2.1部分结果，GLE-M组骨组织微结构改善效果最为理想，故选取sham组、OVX组、GLE-M组进一步IHC染色，以观察各组骨组织中Runx相关转录因子2 (runx-related transcription factor 2，Runx2) 的表达情况。结果显示，Runx2表达水平由高至低依次为sham组(40.2%±3.5%)、GLE-M组(30.1%±2.8%)、OVX组(10.5%±1.9%)。OVX组Runx2的蛋白表达较sham组明显减少(P < 0.01)，GLE-M组OVX大鼠给予中剂量龟鹿二仙胶8周后，Runx2表达水平较OVX组显著增加(P < 0.05)，但并未恢复至sham组Runx2表达水平。提示龟鹿二仙胶干预可提高Runx2的表达水平。见图 1。

2.3 代谢组学分析结果

2.3.1 PCA

结果显示，在正负离子模式下，样本呈聚类分布，说明样本组内差异较小，本实验整个过程稳定性、质量较高。见图 2。

2.3.2 差异代谢物的筛选与鉴定

正负离子模式下，sham组、OVX组与GLE-M组间比较筛选差异代谢物，结果显示，3- (3-甲氧基苯基) 丙酸、乙酰胺、Equol等代谢物在sham组中呈高表达，在OVX组低表达，而在GLE-M组其表达水平又上调恢复至sham组的表达水平，说明GLE可能通过调控丙酸、乙酸等参与调控肠道微生物菌群变化，发挥防治PMO的作用。

2.3.3 差异代谢物通路富集分析

为了深入研究龟鹿二仙胶干预PMO过程中的代谢改变，将鉴定出的差异代谢物进行京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) 富集分析。如图 3所示，sham组与OVX组主要涉及类固醇激素生物合成及皮质醇合成和分泌等代谢通路; GLE-M组与OVX组主要涉及色氨酸代谢、苯丙氨酸代谢、半乳糖代谢和丙氨酸等代谢通路; 与OVX组比较，GLE-M组谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸水平上调，而3-羟基丁酸、牛磺酸、皮质醇、前列腺素G2水平下调。

3 讨论

肾虚可通过影响机体内能量、氨基酸、脂类代谢等多种途径对骨代谢产生影响，被认为是骨质疏松的主要病机^[12-13]。龟鹿二仙胶首载于《医便》，其组成为龟甲胶、鹿角胶、人参、枸杞子，其活性成分具有调节骨代谢的作用^[14-16]。

Runx2能够促进骨形成，是骨骼发育必需的转录因子^[17]。本研究结果显示，PMO模型大鼠骨组织中Runx2的表达较假手术大鼠显著降低，而龟鹿二仙胶则能显著提高Runx2表达水平。PMO可导致氨基酸代谢紊乱，而谷氨酸能够促进钙吸收，提高骨密度^[18]。精氨酸等可通过增强胰岛素样生长因子-1，促进成骨细胞的增殖和分化^[19]。组氨酸能够促进钙吸收，增加骨钙含量^[20]。色氨酸减少被认为是骨质疏松症的典型生物标志物^[21]。本研究发现，龟鹿二仙胶干预后大鼠骨组织中精氨酸等代谢产物上调，并可影响组氨酸、色氨酸代谢通路。

前列腺素具有促进破骨细胞分化的作用^[22]。本研究中，龟鹿二仙胶干预后，大鼠血清中前列腺素G2表达下调，由此推测龟鹿二仙胶可通过降低前列腺素G2的表达防治PMO。皮质醇分泌过多会造成骨密度下降^[23]。本研究通过代谢组学分析发现，模型大鼠PMO的发生与类固醇激素生物合成、皮质醇合成和分泌等代谢通路密切相关。

肠道中的乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸(short-chain fatty acid，SCFA) 与骨代谢关系密切^[24]。本研究结果显示，sham组3- (3-甲氧基苯基) 丙酸呈高表达，OVX组呈低表达，而GLE组则恢复了高表达，而吲哚-3-乙酸也在药物干预后表达水平上调。由此推测龟鹿二仙胶可能通过调节SCFA参与肠道微生物群的变化，从而发挥防治PMO的作用。

总之，龟鹿二仙胶可能通过调控体内的代谢产物来防治PMO，但其更深层次的药理及作用机制尚不明确。本研究利用非靶向代谢组学挖掘了龟鹿二仙胶防治PMO的药理学机制，为探寻防治PMO的中医药治疗方法提供了新的依据。