2025, Vol. 54文章信息
- 冯妮, 李月红
- FENG Ni, LI Yuehong
- 芦丁促进人乳牙牙髓干细胞的增殖及成骨分化
- Rutin promoting the proliferation and osteogenic differentiation of stem cells from human exfoliated deciduous teeth
- 中国医科大学学报, 2025, 54(4): 369-374
- Journal of China Medical University, 2025, 54(4): 369-374
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文章历史
- 收稿日期：2024-05-06
- 网络出版时间：2025-04-10 11:33:17
引用本文 |
牙周炎是以牙菌斑微生物膜为始动因子的慢性感染性疾病，主要病变为牙周袋形成和牙槽骨破坏。这些病变可引起牙周附着的丧失，使牙齿松动、脱落，从而导致患者生活质量下降。如何修复受损的牙周组织并获得再生是牙周炎治疗的关键[1]。人乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHEDs）除了具有低免疫原性和多向分化潜能外，其增殖、血管生成及成骨分化能力强于骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs）及恒牙牙髓干细胞，与人成体牙髓干细胞和人成体牙周韧带干细胞相比，SHEDs成熟度更低，侵入性更小，伦理问题更少。因此，SHEDs被认为是组织工程和干细胞移植中有前景的细胞来源[2]。芦丁除了具有抗炎、抗肿瘤等多种生物学功能外，还可促进牙周韧带干细胞增殖和成骨细胞分化[3]。Janus蛋白酪氨酸激酶2（Janus protein tyrosine kinase 2，JAK2）/信号转导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路参与多种病理过程，其通路的抑制可降低小鼠BMSCs在体外的增殖和成骨分化[4]，而激活该通路可促进大鼠BMSCs成骨细胞分化[5]。本研究旨在探讨芦丁对SHEDs增殖与成骨分化的影响及与JAK2/STAT3信号通路的关系。
1 材料与方法 1.1 主要药品与试剂芦丁（上海源叶生物科技有限公司）；AG490（北
京康瑞纳生物科技有限公司）；MTT试剂盒（江苏麦格生物科技有限公司）；碱性磷酸酶（alkaline phospholipase，ALP）试剂盒（上海羽哚生物科技有限公司）；Runt相关转录因子2（Runt-relatedtranscription factor 2，Runx2）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、ALP引物（广州市锐博生物科技有限公司）；RNA提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（日本TaKaRa公司）；细胞蛋白提取试剂盒（北京凯诗源生物科技有限公司）；兔源一抗Runx2、OCN、ALP、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-actin，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（英国abcam公司）。
1.2 主要仪器ELX800UV酶标仪购自北京百泰克生物技术有限公司；SIGMA 1-14K低温高速离心机购自普迈精医科技（北京）有限公司；CFX96实时定量PCR仪购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；CKX41倒置相差显微镜购自日本奥林巴斯公司。
1.3 临床样本收集选取2020年3月至2021年12月于我院口腔科因正畸拔除的6~10岁儿童乳牙样本（至少剩余2/3牙根的新鲜乳牙，无龋齿、无牙髓炎和牙髓坏死等明显病变）。本研究获得我院伦理委员会批准，且经患儿及监护人知情同意并签署知情同意书。
1.4 SHEDs分离培养将新鲜乳牙用75%乙醇冲洗3次，在无菌条件下取出乳牙的牙髓组织，用PBS反复冲洗，剪碎后接种于α-MEM培养基（含20%胎牛血清，1%青-链霉素）进行常规培养。消化、传代，收集3~5代SHEDs用于后续实验。
1.5 SHEDs的鉴定将第3代SHEDs接种于24孔板（1×104/mL）培养，待细胞融合至80%时，室温下经多聚甲醛（4%）固定15 min、过氧化氢（0.3%）灭活10 min、FBS（10%）封闭20 min、加入波形蛋白和角蛋白抗体孵育2 h，严格按照试剂盒说明书进行染色。激光共聚焦显微镜下观察并拍照。茜素红染色证实SHEDs成骨分化能力。
1.6 细胞分组及处理将SHEDs随机分成control组（正常培养），芦丁低、中、高剂量组（0.1、0.5、1 μmol/L干预24 h）[3]，抑制剂组（1 μmol/L的芦丁+10 μmol/L的JAK2/STAT3通路抑制剂AG490[6]干预24 h）。
1.7 细胞增殖实验各组SHEDs接种于96孔板（1×104/孔），设有6个复孔。24、48、72 h后，每孔加入20 μL MTT溶液共同孵育4 h后离心，除去上清液，每孔加入100 μL二甲基亚砜，使用微振荡器轻轻振荡10 min。当所有紫色晶体完全溶解时，使用酶标仪测量490 nm处的光密度（optical density，OD）值。
1.8 茜素红染色将SHEDs接种于6孔板（1×105/孔），用含有0.1、0.5、1 μmol/L芦丁及1 μmol/L的芦丁+10 μmol/L AG490成骨诱导培养液培养14 d，其间及时更换培养基。14 d后，各组SHEDs经PBS反复漂洗、多聚甲醛（4%）固定15 min、茜素红（2%）染色15 min、双蒸水冲洗，显微镜下观察显色情况。加入CPC溶液（10%）孵育30 min，在酶标仪上于562 nm处检测各孔的OD值，对矿化结节数量进行半定量分析。
1.9 ALP活性检测收集成骨诱导后的各组SHEDs，用0.1% TritonX-100裂解液裂解SHEDs20 min，离心机1 000 r/min离心20 min，收集上清液，按照说明书检测ALP活性。
1.10 实时定量PCR检测Runx2、OCN、ALP mRNA表达水平按照说明书使用TRIzol从各组SHEDs中提取总RNA，NanoDrop 2 000测量RNA浓度。反转录、配置反应体系，实时定量PCR仪进行扩增。Runx2引物序列，正向5’-GGCGGGTAACGATGAAAAT-3’，反向5’-AGGCGGTCAGAGAACAAACTA-3’；OCN引物序列，正向5’-GGCAGCGAGGTAGTGAAGAG-3’，反向5’-CTCACACACCTCCCTCCTG-3’；ALP引物序列，正向5’-ACTGTGGACTACCTCTTG-3’，反向5’-GGTCAGTGATGTTGTTCC-3’；GAPDH引物序列，正向5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，反向5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。Runx2、OCN、ALP的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算。
1.11 Western blotting检测Runx2、OCN、ALP及JAK2/STAT3信号通路蛋白的表达在SHEDS中加入RIPA缓冲液，冰上孵育30 min。离心后收集匀浆的上清液，用BCA蛋白检测试剂盒检测总蛋白浓度。50 μg样品用10% SDS-PAGE分离，之后将分离的蛋白转移到聚偏氟乙烯膜（0.45 mm）上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入Runx2（1∶1 000）、OCN（1∶2 000）、ALP（1∶2 000）、JAK2（1∶1 000）、p-JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、p-STAT3（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）一抗4 ℃孵育过夜，用TBST洗涤3次，每次10 min，然后用山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）在室温下孵育1 h。用Imagepro Plus 6.0对蛋白质进行定量分析。
1.12 统计与分析采用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，计量资料以x±s表示。2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 SHEDs形态观察牙髓组织块培养5~10 d后见细胞爬出，形态大多为纺锤形和长梭形，呈成纤维细胞状，见图 1A。纯化培养后，细胞排列紧密、形态以纺锤形和长梭形为主，见图 1B。
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| A, primary cells (×40); B, 3rd generation purified cells (×200). 图 1 SHEDs形态特征 Fig.1 Morphological characteristics of SHEDs |
2.2 SHEDs的鉴定
免疫组织化学染色结果显示，SHEDs可见波形蛋白染色呈阳性、胞质染成红色，角蛋白染色呈阴性，胞质无着色，见图 2。茜素红染色结果显示，SHEDs成骨诱导14 d后，出现明显的矿化结节，见图 3。
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| A, vimentin staining was positive; B, keratin staining was negative. 图 2 SHEDs免疫组织化学染色×200 Fig.2 Immunohistochemical staining of SHEDs×200 |
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| A, low-magnification visual field (×100);B, high-power field of view (×400). 图 3 SHEDs茜素红染色 Fig.3 Alizarin red staining of SHEDs |
2.3 芦丁对SHEDs增殖的影响
与control组比较，芦丁低、中、高剂量组SHEDs的OD值升高，且芦丁高剂量组SHEDs的OD值最高（P < 0.05）；与芦丁高剂量组比较，抑制剂组SHEDs的OD值降低（P < 0.05），见表 1。
| Group | OD value at 490 nm | ||
| 24 h | 48 h | 72 h | |
| Control | 0.32±0.03 | 0.46±0.05 | 0.65±0.06 |
| Low dose rutin | 0.64±0.071） | 0.78±0.091） | 1.02±0.101） |
| Medium dose rutin | 0.79±0.091） | 0.85±0.071） | 1.17±0.121） |
| High dose rutin | 1.12±0.111），2），3） | 1.34±0.121），2），3） | 1.51±0.131），2），3） |
| Inhibitor | 0.73±0.054） | 0.81±0.074） | 1.09±0.094） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. low dose rutin group；3）P < 0.05 vs. medium dose rutin group；4）P < 0.05 vs. high dose rutin group. | |||
2.4 芦丁对SHEDs中矿化结节数量的影响
与control组（1.69±0.12）比较，芦丁低、中、高剂量组SHEDs矿化结节数量（2.57±0.14、3.11±0.17、3.89±0.21）显著增加，且芦丁高剂量组SHEDs矿化结节数量最多（P < 0.05）；与芦丁高剂量组比较，抑制剂组（2.74±0.15）SHEDs矿化结节数量显著降低（P < 0.05），见图 4。
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| A, control group; B, low dose rutin group; C, medium dose rutin group; D, high dose rutin group; E, inhibitor group. 图 4 各组SHEDs茜素红染色 Fig.4 Alizarin red staining of SHEDs in each group |
2.5 芦丁对ALP活性的影响
与control组（71.36 U/g±4.98 U/g）比较，芦丁低、中、高剂量组SHEDs ALP活性（96.29 U/g±5.41 U/g、118.35 U/g±6.27 U/g、146.72 U/g±7.35 U/g）显著升高，且芦丁高剂量组SHEDs ALP活性最强（P < 0.05）；与芦丁高剂量组比较，抑制剂组（105.96 U/g±5.39 U/g）SHEDs ALP活性显著降低（P < 0.05）。
2.6 芦丁对Runx2、OCN、ALP mRNA表达水平的影响与control组比较，芦丁低、中、高剂量组SHEDs Runx2、OCN、ALP mRNA表达升高，且芦丁高剂量组SHEDs Runx2、OCN、ALP mRNA表达最高（P < 0.05）；与芦丁高剂量组比较，抑制剂组SHEDs Runx2、OCN、ALP mRNA表达降低（P < 0.05），见表 2。
| Group | Runx2 mRNA | OCN mRNA | ALP mRNA |
| Control | 1.00±0.10 | 1.01±0.12 | 1.00±0.11 |
| Low dose rutin | 1.38±0.131） | 1.45±0.131） | 1.36±0.121） |
| Medium dose rutin | 1.82±0.171），2） | 1.96±0.181），2） | 1.78±0.141），2） |
| High dose rutin | 2.59±0.211），2），3） | 2.73±0.251），2），3） | 2.46±0.161），2），3） |
| Inhibitor | 1.46±0.154） | 1.58±0.164） | 1.42±0.134） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. low dose rutin group；3）P < 0.05 vs. medium dose rutin group；4）P < 0.05 vs. high dose rutin group. | |||
2.7 芦丁对Runx2、OCN、ALP及JAK2/STAT3通路蛋白表达的影响
与control组比较，芦丁低、中、高剂量组SHEDs中Runx2、OCN、ALP、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达显著升高，且芦丁高剂量组SHEDs中Runx2、OCN、ALP、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达最高（P < 0.05）；与芦丁高剂量组比较，抑制剂组SHEDs中Runx2、OCN、ALP、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3显著降低（P < 0.05），见图 5、表 3。
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| 1, control group; 2, low dose rutin group; 3, medium dose rutin group; 4, high dose rutin group; 5, inhibitor group. 图 5 Western blotting检测细胞中Runx2、OCN、ALP及JAK2/STAT3通路蛋白表达 Fig.5 The expressions of Runx2, OCN, ALP, and JAK2/STAT3 pathway proteins in cells by Western blotting |
| Group | Runx2/β-actin | OCN/β-actin | ALP/β-actin | p-JAK2/JAK2 | p-STAT3/STAT3 |
| Control | 0.24±0.03 | 0.18±0.02 | 0.21±0.03 | 0.07±0.01 | 0.12±0.01 |
| Low dose rutin | 0.57±0.041） | 0.46±0.051） | 0.54±0.051） | 0.36±0.041） | 0.41±0.051） |
| Medium dose rutin | 0.91±0.081），2） | 0.85±0.071），2） | 0.89±0.091），2） | 0.68±0.051），2） | 0.73±0.081），2） |
| High dose rutin | 1.26±0.121），2），3） | 1.35±0.131），2），3） | 1.41±0.151），2），3） | 0.98±0.091），2），3） | 0.96±0.101），2），3） |
| Inhibitor | 0.65±0.074） | 0.57±0.064） | 0.61±0.064） | 0.41±0.044） | 0.45±0.054） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. low dose rutin group；3）P < 0.05 vs. medium dose rutin group；4）P < 0.05 vs. high dose rutin group. | |||||
3 讨论
SHEDs可以修复包括牙槽骨缺损在内的多种组织缺损，是骨组织工程中理想的种子细胞[7]。本研究采用组织块法获得了SHEDs，细胞多为纺锤形和长梭形，呈成纤维细胞状，细胞抗波形蛋白阳性，抗角蛋白阴性，与岳二丽等[8]的研究结果一致，表明细胞为间充质来源的干细胞。同时，茜素红染色结果表明SHEDs具有明显的成骨细胞分化能力。
芦丁作为果蔬中常见的黄酮类化合物之一，已被证实能够促进细胞增殖并提高细胞中ALP、Runx2、骨桥蛋白的mRNA和蛋白表达，从而促进人牙周韧带干细胞、成骨细胞MC3T3-E1的成骨分化[9-10]。ALP在成骨分化的早期阶段分泌，促进早期钙和磷的沉积，ALP在一定程度上可反映细胞矿化及成骨分化能力，OCN是成骨分化过程中晚期阶段的标志物，可维持骨重建、吸收和矿化[11]。在细胞成骨分化早期，Runx2与其他因子相互作用从而启动成骨细胞分化标志基因（ALP、OCN、骨桥蛋白）的表达，还可以调节间充质干细胞向成骨细胞分化[12]。本研究发现，芦丁干预后SHEDs的OD值、ALP活性、矿化结节数量、Runx2、OCN、ALP mRNA和蛋白表达水平显著升高，与芦丁在人牙髓干细胞成骨分化中的作用类似[13]，提示芦丁提高SHEDs的增殖和成骨分化能力。
JAK2和下游STAT3信号通路在骨骼代谢中起关键作用。基质细胞衍生因子-1及其受体趋化因子受体4的活化，可通过激活JAK2/STAT3信号通路，增加BMSCs矿化结节数量，增强成骨分化能力[14]。高良姜素通过增强JAK2和STAT3的磷酸化，增加人羊膜间充质干细胞中ALP分泌和钙沉积，上调细胞中早期成骨细胞特异性标志物（ALP、Runx2和OSX）以及晚期成骨细胞特异性标志物（Ⅰ型胶原α1链蛋白、骨桥蛋白和OCN）表达，从而促进细胞的成骨分化[6]。然而，WANG等[15]报道柚皮苷通过抑制JAK2/STAT3信号通路，促进大鼠BMSCs增殖和成骨分化，减少骨质疏松症的发生。这些研究表明，JAK2/STAT3信号在干细胞成骨分化中的确切作用较为复杂，可能与药物及细胞来源和种类、实验条件以及信号通路之间复杂的相互作用有关。本研究发现，芦丁能升高p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达水平，而使用该通路抑制剂后，则减弱了芦丁对p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3表达及SHEDs增殖和成骨分化能力的增强作用，提示芦丁可能通过激活JAK2/STAT3信号通路，提高SHEDs的增殖和成骨分化能力。
综上所述，芦丁可能通过激活JAK2/STAT3信号通路，提高SHEDs增殖和成骨分化能力，为SHEDs在牙周骨组织缺损修复的临床应用提供了新的参考。但本研究仍有一定局限性，仅在细胞水平上验证了芦丁的作用，并未进行体内实验，后续研究将会在体内水平进行深入探讨。
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