2025, Vol. 54文章信息
- 姜吉亮, 王文涛, 李乐然, 尹绍卿, 付玉荣, 伊正君
- JIANG Jiliang, WANG Wentao, LI Leran, YIN Shaoqing, FU Yurong, YI Zhengjun
- 铁死亡相关基因作为新型标志物预测结核潜伏感染活化风险及风险模型构建
- Ferroptosis-related genes as novel biomarkers for predicting the risk of latent tuberculosis infection activation and establishment of a risk model
- 中国医科大学学报, 2025, 54(4): 333-339
- Journal of China Medical University, 2025, 54(4): 333-339
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文章历史
- 收稿日期：2024-05-11
- 网络出版时间：2025-04-10 13:26:56
引用本文 |
2. 山东第二医科大学 基础医学院病原生物学教研室，山东 潍坊 261053
2. Department of Pathogenic Biology, School of Basic Medical Sciences, Shandong Second Medical University, Weifang 261053, China
结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染引起的一种慢性传染性疾病，是严重危害人类生命健康的传染病之一。根据疾病状态，可分为活动性结核病（active tuberculosis，ATB）和结核潜伏感染（latent tuberculosis infection，LTBI）。全球约1/4的人群感染Mtb，其中5%~10%可能发展成ATB[1]。研究[2]显示，对LTBI人群进行预防性治疗可以显著降低结核病的发病率。然而，对所有LTBI人群进行预防性治疗并不可行。因此，识别出最有可能在未来几年内发展成ATB的高风险人群，将使预防性治疗更加精准，从而使最有可能受益的人群获益。然而，目前的诊断方法无法早期识别高危人群，并且漏诊率很高。因此，迫切需要寻找更准确、更方便的诊断方法。
近年来，基于宿主转录组的生物标志物在结核病的诊断和监测中获得了广泛的认可[3]。Mtb感染宿主后会引发一系列病理生理变化，包括细胞死亡、炎症反应、干扰素反应和免疫激活等。这些变化会导致分子层面上的异常表达模式[4]，为结核病的诊断提供了新的分子标志物。铁是宿主防御细菌感染的关键因素，在宿主和病原体间的营养斗争中发挥关键作用[5]。研究[6]指出，血清或血浆中的铁水平与结核病的发病率有关。铁过载会引起铁死亡，铁死亡是促进Mtb在宿主中存活和传播的关键机制之一[7]。鉴于宿主严格调控大多数形式的细胞死亡，本研究利用生物信息学和多种机器学习算法，筛选铁死亡相关基因（ferroptosis-related gene，FRG）作为预测LTBI活化风险的新型标志物并建立风险模型。
1 材料与方法 1.1 数据来源从基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）获取GSE112104和GSE19377数据集。GSE112104数据集包括36例LTBI个体和14例ATB患者。经过5年的随访，36例LTBI个体中有16例进展为ATB，称为LTBI进展者（LTBI progressor，LTBIPro），用作训练集。GSE193777数据集包括11例ATB患者和35例LTBI个体，用作验证集。728个FRG来源于FerrDb数据库（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/）。
1.2 加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis，WGCNA）采用WGCNA探索LTBI活化的差异基因模块及其枢纽基因。基于WGCNA包的pickSoftThreshold函数筛选最佳软阈值，使基因间的调控关系符合无尺度网络分布。然后，构建基因分层聚类树，利用动态剪枝法识别基因共表达模块。最后，计算各基因共表达模块与临床组别间的相关性。
1.3 差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）分析使用R语言limma包筛选DEGs。将DEGs和WGCNA中与LTBI活化相关性最强的模块内基因以及FRG取交集，得到LTBI活化相关铁死亡相关差异表达基因（ferroptosis-related differentially expressed genes，FRG-DEGs）。
1.4 铁死亡相关关键基因（ferroptosis-related hub genes，FRG-hubs）的筛选采用最小绝对收缩与选择算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）、支持向量机递归特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）和随机森林（random forest，RF）3种机器学习算法，识别与LTBI活化相关的FRG-hubs。
1.5 骨髓源性巨噬细胞（bone marrow-derived macrophage，BMDM）的培养和感染按照改良的Wayne模型[8]，诱导休眠结核分枝杆菌（dormant Mycobacterium tuberculosis，D-Mtb）。从8周龄C57BL/6小鼠的股骨和胫骨中分离BMDM，悬浮于含10% 胎牛血清（美国Gibco公司）和30 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子的RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）中7 d。用D-Mtb以感染复数=5感染BMDM，感染后6 h更换培养基，记为感染0 h。本研究获得山东第二医科大学实验动物伦理委员会批准（编号：2021SDL528）。
1.6 RNA的提取和逆转录PCR使用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司）从细胞中分离总mRNA，并使用PrimeScriptTM Ⅱ第一链cDNA合成试剂盒（日本TaKaRa公司）制备cDNA，通过逆转录PCR评估mRNA水平。
1.7 基于FRG-hubs建立风险模型使用R语言rms包创建列线图，预测LTBI活化风险。使用校准曲线、决策曲线、受试者操作特征（receiver operating characteristics，ROC）曲线评估模型效能。
2 结果 2.1 筛选参与LTBI活化的FRG在训练集GSE112104中，设定P < 0.05和|log2FC| > 1.5为过滤条件，分别对ATB与LTBI、LTBIPro与LTBI样本表达谱进行差异分析。结果发现，与LTBI相比，LTBIPro中506个基因显著上调，1 132个基因显著下调（图 1A）；ATB中296个基因显著上调，1 569个基因显著下调（图 1B）。WGCNA结果显示，当软阈值为5时，基因间的调控关系符合无尺度网络分布（图 1C），共得到5个基因共表达模块（图 1D），其中蓝色模块与LTBI活化相关性最强（cor=0.62，P = 0.000 04），包含1 340个枢纽基因。将ATB与LTBI、LTBIPro与LTBI的差异基因与WGCNA蓝色模块内的基因以及728个FRG取交集，共得到8个趋势一致的FRG-DEGs（图 1E）。
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| A，volcano plot of genes differentially expressed between LTBI and LTBIPro；B，volcano plot of genes differentially expressed between ATB and LTBI；C，heatmap of module-trait relationships showing clustering of genes associated with LTBI activation；D，heatmap depicting the correlation between gene co-expression modules and LTBI activation；E，Venn diagram illustrating the selection of FRG-DEGs. 图 1 参与LTBI活化的FRG的筛选 Fig.1 Screening of FRG involved in LTBI activation |
2.2 机器学习鉴定FRG-hubs
运用LASSO、SVM-RFE、RF 3种独立机器学习算法，从8个FRG-DEGs中筛选FRG-hubs。在LASSO回归中，通过10倍交叉验证调整最优惩罚参数λ，鉴定出6个基因（图 2A），分别为PLA2G6、TMSB4Y、SNCA、GLS2、JUN、AMN。在SVM-RFE中，n = 5时分类误差最小（0.076 7），确定了5个基因（图 2B），分别为JUN、TMSB4Y、GLS2、PLA2G6、AMN。RF共筛选出5个基因（图 2C），分别为SNCA、TMSB4Y、PPARD、KMT2D、PARP15、GLS2。最终将3种机器学习共有的4个特征基因（图 2D），包括PLA2G6、GLS2、JUN和AMN，作为FRG-hubs，用于后续分析。分别在训练集GSE112104和验证集GSE193777中验证其表达，结果发现，与LTBI相比，LTBIPro和ATB中FRG-hubs均显著下调（图 3A）。ROC曲线（图 3B）显示出良好的诊断效能，曲线下面积在0.76~1.00之间。
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| A，least absolute shrinkage and selection operator（LASSO）algorithm；B，support vector machine-recursive feature elimination（SVM-RFE）algorithm；C，random forest（RF）algorithm；D，Venn diagram illustrating the FRG-hubs common to the LASSO，SVM-RFE，and RF algorithms. 图 2 FRG-hubs的识别 Fig.2 Identification of FRG-hubs |
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| A，expression of FRG-hubs in the GSE193777 dataset；B，diagnostic performance of FRG-hubs in distinguishing ATB and LTBI in the GSE112104 and GSE193777 datasets. *P < 0.01，**P < 0.001. 图 3 FRG-hubs表达和诊断效能验证 Fig.3 Validation of FRG-hubs expressions and diagnostic efficacy |
2.3 D-Mtb活化后FRG-hubs的表达逐渐减少
为了进一步研究LTBI活化过程中FRG-hubs的表达，建立LTBI细胞感染模型。首先诱导D-Mtb，透射电子显微镜下观察，发现D-Mtb细胞壁显著增厚（图 4A），证明D-Mtb被成功诱导。D-Mtb感染BMDM后，金胺O和尼罗红双重染色显示，随着感染时间的延长，绿色荧光逐渐增强，而红色荧光逐渐减弱，表明细胞内D-Mtb逐渐活化（图 4B）。逆转录PCR结果显示，随着感染时间的延长，FRG-hubs的表达水平逐渐降低（图 4C）。
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| A，R-Mtb and D-Mtb were observed under a transmission electron microscope（×25）；B，double staining with auramine O and Nile red at 12，24，48，and 72 h after D-Mtb infection of macrophages（×1 000）；C，expression trend of FRG-hubs after activation of D-Mtb. *P < 0.01，**P < 0.001，***P < 0.000 1. 图 4 D-Mtb的活化抑制FRG-hubs的表达 Fig.4 Activation of D-Mtb suppresses expression of FRG-hubs |
2.4 基于FRG-hubs构建LTBI活化风险模型
基于FRG-hubs开发LTBI活化风险模型，计算活化风险，风险评分=（-10×PLA2G6-3.9279×GLS2-5.1599×JUN+1.2553×AMN）（图 5A）。校准曲线与理想曲线相近，说明模型的预测能力较好（图 5B）。决策曲线变量在很大一个概率阈值区间内高于参考线，说明该变量模型较好（图 5C）。应用ROC曲线评估模型的诊断效能，结果发现，4个FRG-hubs组合在训练集GSE112104（图 5D）和验证集GSE193777（图 5E）的曲线下面积分别为0.982和1.000。
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| A，column plot based on FRG-hubs；B，calibration curve；C，decision curve；D，diagnostic performance of the risk model in distinguishing ATB and LTBI in the GSE112104 dataset；E，diagnostic performance of the risk model in distinguishing ATB and LTBI in the GSE193777 dataset. 图 5 基于FRG-hubs的风险模型的建立和评估 Fig.5 Establishment and evaluation of risk model based on FRG-hubs |
3 讨论
抑制宿主的铁死亡可以阻碍Mtb的传播[9]。在LTBI活化过程中，铁蛋白水平升高，导致细胞内铁浓度升高，诱导氧化应激和铁死亡，从而加剧LTBI活化[10]。本研究通过综合生物信息学分析以及多种机器学习算法筛选FRG，作为预测LTBI活化风险以及区分ATB和LTBI的新型标志物。首先，从LTBI人群和LTBIPro人群中得到LTBI活化的潜在风险基因，在LTBI人群和ATB患者中得到ATB相关基因。然后，通过WGCNA选择与LTBI活化最相关的模块，将三者与FRG取交集，得到8个表达趋势一致的FRG-DEGs。为了得到最佳的基因模型，通过LASSO、SVM-RFE、RF 3种独立机器学习算法，从8个FRG-DEGs中鉴定出4个FRG-hubs，分别为PLA2G6、GLS2、JUN和AMN。在训练集和验证集中验证其表达，结果发现，与LTBI相比，LTBIPro和ATB中FRG-hubs均显著下调。
为了进一步验证研究结果，本研究构建D-Mtb感染巨噬细胞活化模型，使用D-Mtb感染BMDM，分别在12、24、48和72 h提取细胞RNA，逆转录PCR检测FRG-hubs表达量。结果发现，随着D-Mtb的活化，其表达量不断降低。有研究[11]表明，PLA2G6与免疫逃逸有关。GLS2是一种谷胱酰胺代谢酶，影响T细胞的分化和炎性细胞因子的产生[12]。JUN可以和γ干扰素近端启动子结合，从而促进其表达[13]。在LTBI中，Mtb处于潜伏状态，受宿主免疫系统的控制。JUN可能通过调节免疫细胞的活化、增殖和细胞因子的产生，影响LTBI的发展和活化过程。
AMN编码amnionless蛋白，这是一种细胞膜蛋白，在维生素B12的运输和吸收中发挥关键作用[14]。研究[15]表明，维生素B12在调节免疫细胞功能和抗炎过程中发挥重要作用。因此，AMN作为维生素B12的运输蛋白，可能通过调节免疫细胞中维生素B12的水平，影响LTBI的发展和活化过程。FRG-hubs主要与免疫调节、免疫细胞激活以及炎症反应有关，提示FRG-hubs可能影响免疫细胞对Mtb的识别，并调节细胞内代谢，引起机体免疫微环境改变，从而影响LTBI的活化。
鉴于FRG-hubs在LTBI活化过程中的关键作用，本研究建立了LTBI活化风险模型。ROC曲线、校准曲线和决策曲线证明该模型具有良好的准确性和特异度，可以作为LTBI活化风险的预测工具。
本研究仍存在一定的局限性。首先，样本量较小，这可能限制了研究结果的准确性。其次，FRG-hubs影响LTBI活化的具体机制仍不清楚。因此，需要进一步进行临床样本的验证及对FRG-hubs功能的研究。
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