多发性硬化症是一类中枢神经系统自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是最常使用的多发性硬化症动物模型^[1]。EAE的特征是中枢神经系统T细胞浸润，伴有神经脱髓鞘病变、胶质瘢痕等病理症状^[2]。辅助性T细胞1（T helper 1，Th1）和辅助性T细胞17（T helper 17，Th17）是诱发EAE最重要的T细胞亚群^[3]。

瞬时感受器电位香草酸受体1（transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1）是钙离子通道超家族的重要成员，属于感觉神经元中的疼痛受体，在中枢神经系统各个区域均有表达^[4]。TRPV1可以激活固有免疫系统，诱导细胞因子释放和活性氧片段生成，发挥促炎作用，诱导致病性T细胞分化^[5]。然而，TRPV1信号对EAE病理表现和发病机制的影响尚未见研究报道。本研究探讨了抑制TRPV1蛋白表达对EAE进展以及Th1和Th17细胞分化的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

鼠源髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）_35-55、完全弗氏佐剂、百日咳毒素，购自美国Sigma-Aldrich公司；TRPV1抑制剂辣椒平购自美国MCE公司；异硫氰酸荧光素偶联抗小鼠CD4抗体、藻红蛋白偶联抗小鼠白细胞介素（interleukin，IL）-17a抗体、藻红蛋白偶联抗小鼠γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）抗体，购自美国BioLegend公司；劳克坚牢蓝（luxol fast blue，LFB）髓鞘染色试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司。抗鼠TRPV1抗体、抗鼠核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）抗体、抗鼠磷酸化NF-κB（phosphorylated NF-κB，p-NF-κB）抗体、抗鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain，leucine-rich repeat and pyrin domain-containing 3，NLRP3）抗体、抗鼠胱天蛋白酶-1（caspase-1）抗体，购自英国abcam公司；抗鼠β-肌动蛋白（β-actin）抗体、HRP偶联二抗，购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.2 实验动物分组与造模

C57BL/6野生型小鼠36只，由百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司提供。小鼠4~5周龄，体重18~22 g，雌性，饲养于SPF级恒温（23 ℃± 2 ℃）、恒湿（40%~60%）、光暗周期12 h的房间。将小鼠分为对照组、模型组、模型+TRPV1抑制剂组，每组12只。

模型组和模型+TRPV1抑制剂组小鼠构建EAE模型^{[2, 6]}：将MOG_35-55浓度调整至6 mg/mL，与完全弗氏佐剂按1∶1混合，加入终浓度为2 mg/mL的结核杆菌，反复搅拌，制成MOG_35-55乳化剂；将MOG_35-55乳化剂按0.2 mL/只接种在模型组和模型+TRPV1抑制剂组小鼠的背部，共4个点；接种2 h和2 d后，腹腔注射百日咳毒素，500 ng/次。以乳化剂接种当天计为第0天。对照组小鼠背部注射生理盐水，共4个点，0.2 mL/只；接种2 h和2 d后，腹腔注射生理盐水，0.2 mL/只。模型+TRPV1抑制剂组小鼠连续腹腔注射辣椒平溶液，剂量为30 mg/kg，其他2组小鼠腹腔注射生理盐水。给药至第35天，小鼠用5%戊巴比妥钠麻醉后放血处死。

1.3 神经功能评分^[7]

免疫第1~35天，每日上午9时~11时进行神经功能评分。0分，无任何病理症状；1分，尾部张力降低、动作笨拙、步态沉重；2分，尾部无张力、后肢不完全瘫痪，伴有一定步态异常或姿态维持缺乏；3分，后肢瘫痪，伴有轻度前肢乏力、麻痹；4分，肢体严重麻痹、瘫痪，失去翻正反射；5分，濒死状态或死亡。

1.4 LFB染色检查脊髓髓鞘脱失情况

各组随机取4只小鼠，麻醉后放血处死，取脊柱组织，石蜡包埋后切片，经二甲苯洗脱，再经乙醇梯度水化，浸入0.1% LFB溶液中，60 ℃下浸染8~12 h。取出切片，蒸馏水冲洗，在0.05%碳酸锂水溶液中分色10 s，再经70%乙醇分色10 s，蒸馏水冲洗。晾干切片，以中性树脂封片，光学显微镜下观察并拍照。

1.5 流式细胞术检测脊髓CD4⁺T细胞中Th1和Th17细胞占比

首次免疫后第14天，各组随机取4只小鼠，麻醉后放血处死，剥离脊柱，推注预冷PBS溶液冲出脊髓，收集脊髓后1 000 r/min离心5 min，沉淀中加入胰酶消化5 min。再次离心，收集细胞沉淀，加入完全培养基重悬后计数。取1×10⁶个细胞，预冷PBS洗涤，加入抗小鼠CD4蛋白与抗小鼠IFN-γ蛋白或抗小鼠IL-17a蛋白流式荧光抗体（1∶1 000），孵育30 min后，通过流式细胞仪分析各组小鼠脊髓CD4⁺T细胞中Th1和Th17细胞占比。

1.6 Western blotting检测TRPV1和炎症相关蛋白表达

各组随机取4只小鼠，麻醉后放血处死，剥离脊柱，推注预冷PBS溶液冲出脊髓，液氮冷冻后粉碎，加入蛋白裂解液搅拌、混匀、静置。离心后收集上清，制成样品。取SDS-PAGE凝胶，每个样品孔中加入10 μg样品，进行凝胶电泳。通过湿法转移法将凝胶上蛋白转移至PVDF膜上，山羊血清中封闭，加入一抗孵育过夜。次日，洗去一抗，孵育二抗，PVDF膜表面滴加超敏发光液，化学发光成像仪下显影，获得蛋白条带。将目标蛋白条带灰度值与内参蛋白灰度值对比，获得蛋白相对表达值。

1.7 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.0软件分析数据。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Tukey’s事后检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 TRPV1信号对EAE模型小鼠神经功能的影响

对照组小鼠未出现任何EAE症状。第7天起，模型组与模型+TRPV1抑制剂组小鼠均陆续出现神经功能损伤症状。第14天时，模型组小鼠神经功能评分达到峰值。与模型组比较，模型+TRPV1抑制剂组小鼠神经功能评分明显降低（P < 0.05）。达到峰值后，各组小鼠EAE症状逐渐缓解。至观察期末，模型+TRPV1抑制剂组小鼠神经功能基本恢复，神经功能评分明显低于模型组（P < 0.05）。见表 1。

2.2 TRPV1信号对EAE模型小鼠脊髓的影响

对照组小鼠脊髓髓鞘完整。模型组小鼠脊髓髓鞘脱失明显，局部染色较淡，髓鞘间距增加且有较多空泡区，部分小鼠甚至出现髓鞘断裂情况。与模型组相比，模型+TRPV1抑制剂组小鼠髓鞘脱失部分恢复，虽仍有部分髓鞘破坏，但空泡较少且鲜有髓鞘断裂。见图 1。

2.3 TRPV1信号对EAE模型小鼠Th1和Th17细胞分化的影响

与对照组相比，模型组小鼠脊髓CD4⁺T细胞中Th1和Th17细胞占比明显增加（P < 0.05）。与模型组相比，模型+TRPV1抑制剂组小鼠脊髓CD4⁺T细胞中Th1和Th17细胞占比明显减少（P < 0.05）。见图 2。

2.4 EAE模型小鼠中TRPV1蛋白和炎症反应蛋白的表达

与对照组相比，模型组小鼠脊髓中TRPV1蛋白表达水平明显升高（P < 0.05），炎症相关蛋白p-NF-κB、caspase-1和NLRP3蛋白表达水平明显升高（P < 0.05）。与模型组相比，模型+TRPV1抑制剂组小鼠脊髓中TRPV1蛋白表达水平明显降低（P < 0.05），p-NF-κB、caspase-1和NLRP3蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）。见图 3。

3 讨论

本研究改进了EAE模型构建方法^{[2, 6]}，结果显示，模型组小鼠陆续出现不同程度的神经功能损伤症状表现，神经功能评分在免疫后第14天达到峰值，小鼠表现出尾部肌张力丧失伴有后肢瘫痪的症状。LFB染色结果显示，EAE模型小鼠脊髓髓鞘脱失明显。多发性硬化症以髓鞘脱失后形成胶质瘢痕为临床病理特征^[8]，因此本研究EAE模型构建成功。

EAE模型主要是由中枢神经系统抗原诱发T细胞的自身免疫反应引起^[5]。最初研究^[9]认为，EAE进展主要由Th1细胞分泌的IFN-γ诱导，且临床分析显示多发性硬化症患者体内IFN-γ水平明显高于健康人群。后来发现，特异性抑制Th1细胞分化无法完全减轻EAE症状。最近研究^[10]认为，IL-17也与EAE进展相关。IL-17主要由CD4⁺Th17细胞分泌，有研究^[11]将CD4⁺Th17细胞转移至小鼠体内，能够明显加速EAE进展，但同等数量的Th1细胞作用却不显著。本研究同时考察了Th1和Th17细胞在EAE模型中的变化，结果显示，与对照组相比，Th1和Th17细胞在CD4⁺T细胞中占比明显增加。提示本研究诱发小鼠EAE的发病机制与文献^[9-11]报道一致。

近年来研究显示，TRPV1蛋白在中枢神经系统中广泛表达，其研究范围已不再局限于温度和疼痛感知^[12]，其对炎症疾病的影响越来越受到关注^[13]。TRPV1已被发现可以激活固有免疫反应，并通过级联反应诱导T细胞分化^[3]。已有研究^[4]证实，TRPV1信号可以通过增加固有免疫系统中小胶质细胞膜表面Ca²⁺内流和磷酸酶PP2A的活性来调控NLRP3炎症小体的激活。本研究通过抑制TRPV1蛋白表达，探讨了TRPV1在EAE进展过程中的作用。结果显示，与模型组相比，模型+TRPV1抑制剂组小鼠神经功能评分达峰时间延迟，峰值降低。同时，模型+TRPV1抑制剂组小鼠脊髓髓鞘脱失改善，Th1和Th17细胞占比明显减少，此外，TRPV1蛋白与炎症相关蛋白p-NF-κB、caspase-1和NLRP3蛋白表达水平明显降低。因此，在EAE进展中，抑制TRPV1蛋白表达极可能发挥了抑制Th1和Th17细胞分化作用。提示MOG_35-55和结核杆菌乳化剂诱导的EAE模型，极可能通过TRPV1蛋白调节下游炎症信号通路，发挥促进Th1和Th17细胞分化作用。值得注意的是，有研究^[14]显示，TRPV1基因敲除明显降低了细胞内氧化应激，阻断了Ca²⁺内流，抑制了炎症，增加抗氧化基因表达，且在一定程度上阻止了促炎症物质诱导的线粒体分裂。这进一步验证了TRPV1蛋白在炎症反应中的促进作用。

综上所述，TRPV1蛋白表达对EAE的进展起重要作用，主要通过提高TRPV1蛋白表达水平，诱发炎症反应，促进Th1和Th17细胞分化，引起脊髓组织髓鞘脱失。抑制TRPV1蛋白表达能够明显减轻炎症反应，减少Th1和Th17细胞分化，改善EAE模型小鼠的神经功能。