研究^[1]显示，全球每年发生急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）患者超过1 000万，病死率约为10%；恢复肾功能患者中也有相当高的比例会进展为慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）。近年来研究^[2]发现，肾小管上皮细胞线粒体损伤是AKI的早期病理表现，随着疾病的进展，逐渐出现肾脏纤维化。去乙酰化酶Sirt3对于维持线粒体稳态至关重要^[3]。前期研究^[4]显示，多肽apelin具有减轻AKI的作用，但其机制尚未完全阐明。本研究采用顺铂刺激体外培养的肾小管上皮细胞和顺铂诱导的AKI小鼠模型，通过外源性补充apelin、敲减Sirt3等方法探讨apelin是否通过调节Sirt3来发挥肾脏保护作用，旨在为揭示AKI向CKD进展的新治疗靶点提供依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

顺铂、apelin-13、JC-1检测试剂盒（美国Sigma公司），线粒体荧光探针、Lipo2000转染试剂（美国Thermo公司），兔抗人Sirt3抗体（美国CST公司），兔抗人转化生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）抗体、兔抗小鼠Ⅰ型胶原（typeⅠ collegen，Col-Ⅰ）抗体（英国abcam公司），辣根过氧化物酶标记IgG抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（南京建成生物工程公司）；MultiSkan3酶标仪（美国Thermo公司），LEICA2016石蜡切片机（德国Leica公司），BX51光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.2 细胞培养及分组

原代人近端肾小管上皮细胞购自美国ScienCell公司，将其分为5个实验组：对照组、顺铂组、顺铂+ apelin组、顺铂+apelin+Sirt3 siRNA组和apelin组。细胞经复苏后按1 ∶ 4传代，将其置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中静置培养。当细胞长至90%融合时，换用含顺铂（10 µmol/L）和（或）apelin-13（1 µmol/L）的培养基继续孵育48 h，收集各组细胞用于后续实验。

1.3 细胞转染

Sirt3 siRNA由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染前1 d用不含抗生素的培养基培养，待细胞融合达50%时进行转染。用Opti-MEM分别溶解Lipofectamine 2000转染试剂和siRNA序列，然后混合静置。去除培养基，加入混合后的转染溶液，置于37 ℃培养箱中，6 h后更换新鲜培养基继续培养48 h，荧光显微镜下观察转染情况。转染效率（%）=荧光下细胞数/明场下细胞数×100，转染效率70%~80%为转染成功。

1.4 动物模型建立及分组

10周龄雄性C57BL/6J小鼠，体重22~24 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在温度（22±1）℃、湿度（55±5）%的SPF级动物实验室饲养。Sirt3敲减腺病毒和空载腺病毒由汉恒生物科技（上海）有限公司合成。设立5个实验组：对照组、顺铂组、顺铂+apelin组、顺铂+apelin+Sirt3敲减组、空载腺病毒组。除对照组和空载腺病毒组外，其他组小鼠一次性腹腔注射顺铂（20 mg/kg）建立AKI模型。顺铂+ apelin-13组小鼠腹腔注射apelin-13（0.1 μg·kg^-1·d^-1），对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水，持续2周；顺铂+ apelin+Sirt3敲减组小鼠尾静脉注射Sirt3敲减腺病毒（2×10⁹ pfu/mL），腹腔注射apelin-13（0.1 μg·kg^-1· d^-1），持续2周；空载腺病毒组小鼠尾静脉注射空载腺病毒（2×10⁹ pfu/mL）。实验结束留取各组小鼠血液标本，麻醉后处死小鼠并留取肾脏组织。

1.5 线粒体形态观察

采用MitoTracker^Ⓡ试剂盒对细胞线粒体进行染色。实验前在24孔培养板内覆盖盖玻片，进行细胞爬片培养，细胞融合达70%~80%时吸除培养基，加入37 ℃预热的染色工作液，37 ℃、5% CO₂条件下孵育15~45 min，洗涤细胞，多聚甲醛固定后利用荧光显微镜进行观察。

1.6 线粒体膜电位检测

采用JC-1探针标记细胞线粒体，进行荧光酶标法检测。使用工作液（0.5 mL）重悬细胞，37 ℃、5%CO₂培养箱孵育15~30 min后使用300 μL缓冲液重悬细胞。将染色好的细胞转移至黑色96孔板，用荧光酶标仪测量线粒体膜电位。正常线粒体膜电位较高，JC-1聚集在线粒体基质中，荧光呈红色（Ex=585 nm，Em=590 nm）；损伤线粒体膜电位下降，JC-1以单体形式存在于胞质中，荧光呈绿色（Ex=514 nm，Em=529 nm）。线粒体膜电位通过红色荧光百分比来表示。

1.7 Western blotting检测蛋白表达

PBS洗涤细胞，加入组织裂解液，4 ℃、12 000 g离心30 min。取100 μg蛋白进行12% SDS-PAGE，随后转移至PVDF膜，用5% BSA-PBST封闭1 h。加入兔抗人抗体，于4 ℃孵育过夜，再用辣根过氧化物酶标记的二抗于室温孵育1 h。洗膜后用ECL法显色，以β-tubulin作内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.8 小鼠肾脏组织学观察

用4%多聚甲醛固定各组肾脏组织，石蜡包埋切片（厚度3 μm）后进行Masson染色，各组随机挑选5个视野，观察各组肾脏组织的纤维化程度，纤维化程度用阳性染色区域百分比表示。肾组织石蜡包埋切片（厚度5 μm）后进行Col-Ⅰ的免疫组织化学染色，各组随机挑选5个视野，计算阳性染色区域的百分比。

1.9 小鼠肾功能检测

各组小鼠血液标本置于EDTA抗凝的真空采血管。4 000 g离心15 min，收集上清液，用ELISA试剂盒检测各组血清肌酐（creatinine，Cr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平，操作按试剂盒说明书进行。

1.10 统计学分析

利用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 siRNA转染对Sirt3表达的影响

Western blotting结果显示，与对照组比较，Sirt3 siRNA转染组细胞Sirt3蛋白的表达量明显降低，说明Sirt3 siRNA模型制备成功，见图 1。

2.2 各组肾小管上皮细胞线粒体形态比较

细胞经过MitoTracker^Ⓡ试剂盒染色后，具有活性的线粒体会摄取携带红色荧光的物质。如图 2所示，对照组细胞线粒体分布在细胞核周围，呈条带状，相互连结成网。与对照组比较，顺铂组细胞核周围的红色区域减少，荧光强度减弱，提示线粒体数量和形态异常。与顺铂组比较，顺铂+apelin组细胞线粒体的染色有所改善。与顺铂+apelin组比较，顺铂+ apelin+Sirt3 siRNA组细胞线粒体数量和形态异常，apelin的改善作用受到显著抑制。apelin组线粒体的形态与对照组比较无明显差异。

2.3 各组肾小管上皮细胞线粒体膜电位比较

荧光酶标法检测结果显示，对照组、顺铂组、顺铂+apelin组、顺铂+apelin+Sirt3 siRNA组、apelin组细胞线粒体膜电位分别为（96.33±1.51）%、（61.29± 7.25）%、（86.66±5.90）%、（65.57±6.31）%和（95.01± 3.92）%。与对照组比较，顺铂组肾小管上皮细胞线粒体膜电位显著降低（P＜0.05）。与顺铂组比较，顺铂+apelin组线粒体膜电位明显改善（P＜0.05）。与顺铂+apelin组比较，顺铂+apelin+Sirt3 siRNA组apelin对线粒体膜电位的保护作用明显削弱（P＜0.05）。见图 3。

2.4 Apelin抑制顺铂诱导的促纤维化细胞因子TGF-β1表达

Western blotting结果显示，对照组、顺铂组、顺铂+apelin组、顺铂+apelin+Sirt3 siRNA组、apelin组TGF-β1表达量分别为1.00±0.00、4.50±0.41、1.84± 0.33、4.19±0.44、1.18±0.21。与对照组比较，顺铂组TGF-β1表达明显升高（P＜0.05）。与顺铂组比较，顺铂+apelin组TGF-β1表达显著抑制（P＜0.05）。与顺铂+apelin组比较，顺铂+apelin+Sirt3 siRNA组apelin对TGF-β1表达的抑制作用明显削弱（P＜0.05）。见 图 4。

2.5 Apelin减轻顺铂诱导的AKI小鼠肾间质纤维化和胶原的表达

Masson染色结果显示，与对照组比较，顺铂组小鼠出现明显肾小管萎缩和肾间质纤维化（P＜0.05）。与顺铂组比较，顺铂+apelin组小鼠肾脏纤维化程度减轻（P＜0.05）。与顺铂+apelin组比较，顺铂+apelin+ Sirt3敲减组小鼠肾间质纤维化程度加重（P＜0.05）。空载腺病毒组小鼠肾脏形态与对照组相似。免疫组织化学染色结果显示，与对照组比较，顺铂组小鼠肾脏Col-Ⅰ主要分布在肾间质，表达明显增多（P＜0.05）。与顺铂组比较，顺铂+apelin组小鼠Col-Ⅰ表达明显减少（P＜0.05）。顺铂+apelin+Sirt3敲减组小鼠Col-Ⅰ表达量接近顺铂组水平。空载腺病毒组小鼠肾间质仅有极少量Col-Ⅰ表达，见图 5、表 1。

2.6 Apelin改善顺铂诱导的AKI小鼠肾脏功能

ELISA检测结果显示，顺铂组小鼠Cr和BUN水平明显高于对照组（P＜0.05）。与顺铂组比较，顺铂+ apelin组小鼠肾损伤减轻，Cr和BUN水平显著降低（P＜0.05）。与顺铂+apelin组比较，顺铂+apelin+Sirt3敲减组小鼠Cr和BUN显著升高（P＜0.05）。空载腺病毒组小鼠Cr和BUN水平与对照组比较无统计学意义。见表 1。

3 讨论

研究^[5]显示，AKI和CKD相互关联，AKI患者易进展为CKD，而CKD患者对AKI的危险因素更为敏感，反复损伤后肾功能恶化加速。AKI的病因包括创伤、感染、手术等引起的肾脏缺血和接触肾毒性物质（非甾体药物、抗生素、抗肿瘤药物等[6]）。临床上AKI发生隐匿，常存在多种致病因素，病理过程复杂。因此，明确AKI的发病机制是目前关注的热点。

肾脏近端肾小管上皮细胞只能依赖有氧代谢供能，其线粒体处于氧化活跃状态，对损伤最为敏感。AKI以近端肾小管坏死为主要病理表现^[7]；随着疾病的进展，肾小管上皮细胞进行上皮-间质转化，并分泌大量胶原成分，出现肾间质纤维化、肾小球硬化等病理改变，最终肾脏失去正常的结构和功能^[8]。线粒体蛋白的翻译后修饰参与线粒体稳态的调节，其中去乙酰化酶Sirt3发挥重要作用^[9]。已有研究^[10]证实，顺铂诱导的AKI小鼠腹腔注射水飞蓟素可增加Sirt3表达，改善线粒体功能，减少肾小管上皮细胞凋亡。

Apelin是一种内源性活性肽，在人体生理和病理过程中的潜在作用备受关注。目前研究^[11]已证实，外源性apelin可以降低耳蜗外植体中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，恢复线粒体膜电位，减少促凋亡因子的表达。Apelin预处理可以有效降低超氧阴离子的产生，抑制DNA损伤，减轻顺铂的心脏毒性^[12]。本研究结果显示，顺铂可引起肾小管上皮细胞线粒体形态和膜电位异常。在顺铂刺激的肾小管上皮细胞中加入apelin，可以稳定线粒体的形态和膜电位，减少TGF-β1分泌，与以往研究结果一致。

本研究结果显示，通过siRNA转染下调Sirt3表达，会显著削弱apelin的肾脏保护作用。提示apelin减轻顺铂对肾小管上皮细胞线粒体的损伤，抑制AKI向CKD转化的生物学效应可能依赖于去乙酰化酶Sirt3。线粒体中Sirt3可直接结合并调控琥珀酸脱氢酶A，使ATP生成增加；在线粒体膜去极化过程中，Sirt3诱导特定的基质蛋白簇发生反应，增强线粒体功能^[13]。最近的研究^[14]发现，Sirt3能够调控近端肾小管上皮细胞间的微管网络，从而保护细胞的生物能量谱和氧化防御机制，而这些作用也是高度依赖线粒体供能的。可见，肾脏的能量代谢极其旺盛，线粒体功能异常与很多肾脏疾病密切相关，去乙酰化酶Sirt3可能是治疗肾脏疾病的新靶点。

综上所述，多肽apelin通过调节去乙酰化酶Sirt3来维持肾小管上皮细胞线粒体结构和功能的稳定，减轻肾脏纤维化，改善肾功能，抑制AKI向CKD转化。本研究仅通过细胞和动物实验对apelin保护肾小管上皮细胞线粒体的作用进行了初步探讨，apelin调节Sirt3的具体机制仍未明确，有待后续进一步论证。