2025, Vol. 54文章信息
- 谷君, 任卫东, 李会贤, 邓文娟, 胡利梅, 刘慧颖, 蔡裕
- GU Jun, REN Weidong, LI Huixian, DENG Wenjuan, HU Limei, LIU Huiying, CAI Yu
- circHIPK2调节miR-7-5p/TCF4轴对血管紧张素Ⅱ诱导的血管内皮细胞凋亡的影响
- Effect of circHIPK2 on angiotensin Ⅱ-induced apoptosis of vascular endothelial cells through regulation of the miR-7-5p/TCF4 axis
- 中国医科大学学报, 2025, 54(3): 257-261, 267
- Journal of China Medical University, 2025, 54(3): 257-261, 267
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文章历史
- 收稿日期：2024-03-19
- 网络出版时间：2025-03-19 10:48:19
引用本文 |
2. 河北北方学院附属第一医院心血管内科，河北 张家口 075000
2. Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China
高血压是临床常见的心血管疾病之一[1]。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）是诱导血管内皮损伤进而导致高血压的关键因子，炎症反应、氧化应激和凋亡信号涉及其中，通过抑制氧化应激和炎症可有效减轻血管内皮损伤、改善高血压症状[2-3]。环状RNA同源域相互作用蛋白激酶2（circRNA-homeo-domain-interacting protein kinase 2，circHIPK2）可通过充当微RNA海绵，在包括高血压在内的多种疾病中发挥作用。在高血压患者的血管平滑肌细胞中circHIPK2表达显著上调[4]，沉默circHIPK2可减轻H2O2引起的小鼠心肌氧化损伤及凋亡[5]。miR-7-5p可消除异氟醚诱导的大鼠神经炎症和氧化应激[6]，对肺动脉高压发挥潜在治疗作用[7]。转录因子4（transcription factor 4，TCF4）是重要的炎症调控因子，降低其表达可减轻软骨细胞凋亡、炎症损伤[8]，还可改善缺氧诱导的肺动脉高压大鼠血管重塑[9]。由此可见，circHIPK2、miR-7-5p和TCF4是潜在的高血压治疗靶点。研究[10]表明，miR-7-5p可靶向下调TCF4表达，但circHIPK2是否可通过调节miR-7-5p/TCF4轴影响AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡，目前还不清楚。本文通过研究circHIPK2调节miR-7-5p/TCF4轴对AngⅡ诱导的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）凋亡的影响，深入阐释高血压的发生机制，为其治疗提供新的靶点。
1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器HUVEC，购自合肥万物生物科技有限公司；circHIPK2 siRNA及其阴性对照，miR-7-5p mimics、inhibitor及其阴性对照，购自汉恒生物科技（上海）有限公司；AngⅡ（纯度≥98%，批号06011508），购自美国Enzo Life Sciences公司；一步法实时定量PCR试剂盒、MTT检测试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、DCFH-DA活性氧（reactive oxygen，ROS）检测试剂盒，购自北京百奥莱博科技有限公司；JC-1法线粒体膜电位检测试剂盒、人白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β和IL-18酶联免疫吸附试验试剂盒，购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性检测试剂盒，过氧化氢酶（catalase，CAT）活性检测试剂盒，兔源抗人Bax、Bcl-2、GAPDH和TCF4一抗，小鼠抗兔二抗，购自英国abcam公司。
CFX Opus 384实时定量PCR仪，购自广州国奥生物技术有限公司；EnVision Nexus酶标仪，购自瑞孚迪生物医学（上海）有限公司；SFLO流式细胞仪，购自杭州谱育科技发展有限公司；NCF950激光共聚焦荧光显微镜，购自广州市明慧科技有限公司；DYCZ-40K转印电泳仪、DYY-6D电源、DYCZ-20H垂直电泳仪，购自山东博浩生物科技有限公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞模型的建立和分组快速取出HUVEC，解冻培养，传代2次后在24孔板内接种，随机分为对照组、模型组、阴性对照共转染组、敲低circHIPK2组、过表达miR-7-5p组、敲低circHIPK2+敲低miR-7-5p组。除对照组外，其余各组给予10 nmol/L AngⅡ[11]诱导。根据分组进行转染处理：对照组细胞不用AngⅡ诱导也不进行转染；模型组细胞不进行转染；阴性对照共转染组细胞转染circHIPK2阴性对照和miR-7-5p阴性对照；敲低circHIPK2组细胞转染circHIPK2 siRNA；过表达miR-7-5p组细胞转染miR-7-5p mimics；敲低circHIPK2+敲低miR-7-5p组细胞转染circHIPK2 siRNA和miR-7-5p inhibitor。各组细胞均处理24 h。
1.2.2 实时定量PCR检测各组细胞circHIPK2、miR-7-5p和TCF4 mRNA表达应用TRIzol试剂提取各组HUVEC总RNA，采用一步法实时定量PCR试剂盒中预混液配制PCR反应体系，按照试剂盒说明书进行PCR，采用2-ΔΔCt法计算各基因循环阈值。circHIPK2、TCF4的内参为GAPDH，miR-7-5p的内参为U6，以内参为基准，量化各组细胞circHIPK2、miR-7-5p和TCF4 mRNA相对表达。引物序列：circHIPK2，正向5’-AGGTCTTATCCACGCTGACC-3’，反向5’-GAAGGGTGTGAGGGGAGAAA-3’；TCF4，正向5’-CAAAAACCAGAGCCAGGTGC-3’，反向5’-GGAGCATAGACTGAAGATGGCA-3’；GAPDH，正向5’-TATGATATCAAGAGGGTAGT-3’，反向5’-TGTATCCAAACTCATTGTCATAC-3’；miR-7-5p，正向5’-ACGTTGGAAGACTAGTGATTT-3’，反向5’-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3’；U6，正向5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。
1.2.3 MTT法和流式细胞术检测各组细胞增殖和凋亡HUVEC传代后接种在96孔板内，培养至对数生长期，分组处理后采用MTT工作液孵育各组细胞，检测各组细胞光密度值，评价各组细胞活力。
收集分组处理后的各组HUVEC，用PBS洗涤，制成单细胞悬液，每组取约5×105个细胞，加入ArmexinV-FITC和碘化丙啶染色液避光双染，洗涤后采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.2.4 JC-1染色检测各组细胞线粒体膜电位分组处理后的各组HUVEC用PBS洗涤后，加入JC-1染料孵育，激光共聚焦荧光显微镜下观察、拍照后定量荧光强度，以红色与绿色荧光强度的比值表示线粒体膜电位高低。
1.2.5 各组细胞ROS表达、抗氧化酶活性和促炎性细胞因子水平的检测分组处理后的各组HUVEC用PBS洗涤后，加入DCFH-DA荧光探针孵育，根据ROS检测试剂盒说明书中检测各组ROS相对表达；裂解分组处理后的各组细胞，采用SOD和CAT活性检测试剂盒检测各组细胞SOD和CAT活性；采用酶联免疫吸附试验试剂盒检测各组细胞IL-6、IL-1β、IL-18水平。
1.2.6 Western blotting检测各组细胞凋亡相关蛋白和TCF4蛋白表达提取分组处理后的各组HUVEC总蛋白，变性后每组取20 µg上样做电泳分离，接下来进行湿转转印，根据分子量裁下Bcl-2、Bax、TCF4和GAPDH蛋白条带，分别孵育一抗、二抗后显色，拍照后测定蛋白灰度值，分析各组蛋白相对表达水平。
1.3 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料用x±s表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，采用SNK-q检验进行进一步两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组细胞中circHIPK2、miR-7-5p和TCF4 mRNA表达水平的比较与对照组相比，模型组miR-7-5p表达水平降低（P < 0.05），circHIPK2和TCF4 mRNA表达水平升高（P < 0.05）。与模型组相比，敲低circHIPK2组miR-7-5p表达水平升高（P < 0.05），circHIPK2和TCF4 mRNA表达水平降低（P < 0.05）；过表达miR-7-5p组miR-7-5p表达水平升高（P < 0.05），TCF4 mRNA表达水平降低（P < 0.05）。与敲低circHIPK2组相比，敲低circHIPK2+敲低miR-7-5p组miR-7-5p表达水平降低（P < 0.05），TCF4 mRNA表达水平升高（P < 0.05）。见表 1。
| Group | n | circHIPK2 | miR-7-5p | TCF4 mRNA |
| Control | 6 | 1.00±0.16 | 1.02±0.12 | 0.99±0.17 |
| Model | 6 | 2.31±0.221） | 0.35±0.061） | 2.20±0.231） |
| Negative control cotransfection | 6 | 2.34±0.211） | 0.34±0.081） | 2.21±0.211） |
| circHIPK2 knockdown | 6 | 1.12±0.182） | 0.94±0.132） | 1.07±0.192） |
| miR-7-5p overexpression | 6 | 2.28±0.15 | 0.97±0.112） | 1.03±0.182） |
| circHIPK2 siRNA knockdown+miR-7-5p knockdown | 6 | 1.15±0.17 | 0.32±0.073） | 2.14±0.203） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. circHIPK2 knockdown group. | ||||
2.2 各组细胞增殖、凋亡、线粒体膜电位的比较
与对照组相比，模型组细胞活力和线粒体膜电位降低（P < 0.05），凋亡率升高（P < 0.05）。与模型组相比，敲低circHIPK2组、过表达miR-7-5p组细胞活力和线粒体膜电位升高（P < 0.05），凋亡率降低（P < 0.05）。与敲低circHIPK2组相比，敲低circHIPK2+敲低miR-7-5p组细胞活力和线粒体膜电位降低（P < 0.05），凋亡率升高（P < 0.05）。见表 2、图 1。
| Group | n | Cell viability | Apoptosis rate（%） | Mitochondrial membrane potential |
| Control | 6 | 1.48±0.13 | 4.73±1.51 | 32.63±5.12 |
| Model | 6 | 0.92±0.081） | 42.15±3.261） | 20.95±3.531） |
| Negative control cotransfection | 6 | 0.90±0.071） | 44.61±3.201） | 20.18±3.361） |
| circHIPK2 knockdown | 6 | 1.31±0.112） | 6.18±1.902） | 29.72±3.412） |
| miR-7-5p overexpression | 6 | 1.39±0.102） | 5.36±1.682） | 30.84±3.272） |
| circHIPK2 siRNA knockdown+miR-7-5p knockdown | 6 | 0.98±0.123） | 38.20±3.133） | 22.14±3.483） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. circHIPK2 knockdown group. | ||||
|
| 图 1 各组细胞线粒体膜电位的JC-1染色图 ×200 Fig.1 JC-1 staining of mitochondrial membrane potential among the groups ×200 |
2.3 各组细胞ROS相对表达水平、抗氧化酶活性和促炎性因子水平的比较
与对照组相比，模型组ROS相对表达水平以及IL-6、IL-1β、IL-18水平升高（P < 0.05），SOD和CAT活性降低（P < 0.05）。与模型组相比，敲低circHIPK2组、过表达miR-7-5p组ROS相对表达水平以及IL-6、IL-1β、IL-18水平降低（P < 0.05），SOD和CAT活性升高（P < 0.05）。与敲低circHIPK2组相比，敲低circHIPK2+敲低miR-7-5p组ROS相对表达水平以及IL-6、IL-1β、IL-18水平升高（P < 0.05），SOD和CAT活性降低（P < 0.05）。见表 3、图 2。
| Group | n | Relative expression of ROS | SOD（U/g prot） | CAT（U/g prot） | IL-6（ng/kg prot） | IL-1β（ng/kg prot） | IL-18（ng/kg prot） |
| Control | 6 | 1.00±0.26 | 27.42±4.83 | 15.30±2.84 | 97.14±16.13 | 48.63±13.59 | 196.84±21.65 |
| Model | 6 | 4.97±0.501） | 6.95±2.161） | 3.12±1.021） | 426.75±28.621） | 173.26±22.841） | 629.36±32.841） |
| Negative control cotransfection | 6 | 5.14±0.481） | 6.34±2.301） | 2.79±0.911） | 435.23±27.491） | 182.54±21.361） | 632.75±30.931） |
| circHIPK2 knockdown | 6 | 1.25±0.272） | 24.79±4.252） | 12.86±2.502） | 118.30±18.252） | 59.72±14.232） | 219.78±19.572） |
| miR-7-5p overexpression | 6 | 1.13±0.412） | 25.98±4.192） | 13.91±2.622） | 109.12±19.432） | 52.97±13.782） | 208.90±20.862） |
| circHIPK2 siRNA knockdown+miR-7-5p knockdown | 6 | 4.78±0.393） | 8.16±2.473） | 3.94±1.233） | 412.36±26.943） | 167.18±21.953） | 613.69±31.293） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. circHIPK2 knockdown group. | |||||||
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| 图 2 各组细胞ROS表达的DCFH-DA荧光探针检测图 ×400 Fig.2 DCFH-DA fluorescence probe detection of ROS expression among the groups ×400 |
2.4 各组细胞凋亡相关蛋白表达水平的比较
与对照组相比，模型组Bcl-2蛋白表达水平降低（P < 0.05），Bax和TCF4蛋白表达水平升高（P < 0.05）。与模型组相比，敲低circHIPK2组、过表达miR-7-5p组Bcl-2蛋白表达水平升高（P < 0.05），Bax和TCF4蛋白表达水平降低（P < 0.05）。与敲低circHIPK2组相比，敲低circHIPK2+敲低miR-7-5p组Bcl-2蛋白表达水平降低（P < 0.05），Bax和TCF4蛋白表达水平升高（P < 0.05）。见表 4。
| Group | n | Bcl-2 protein | Bax protein | TCF4 protein |
| Control | 6 | 0.79±0.16 | 0.20±0.06 | 0.31±0.09 |
| Model | 6 | 0.29±0.091） | 0.63±0.101） | 0.72±0.151） |
| Negative control cotransfection | 6 | 0.28±0.081） | 0.65±0.111） | 0.74±0.141） |
| circHIPK2 knockdown | 6 | 0.75±0.152） | 0.25±0.082） | 0.36±0.112） |
| miR-7-5p overexpression | 6 | 0.73±0.132） | 0.23±0.072） | 0.34±0.102） |
| circHIPK2 siRNA knockdown+miR-7-5p knockdown | 6 | 0.31±0.103） | 0.59±0.093） | 0.68±0.133） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.05 vs. circHIPK2 knockdown group. | ||||
3 讨论
炎症和过氧化反应是AngⅡ诱导的HUVEC损伤的主要原因，增强抗氧化功能并抑制炎症能够有效减轻AngⅡ诱导的内皮功能障碍和高血压[2-3]。circHIPK2可通过调控炎症广泛参与人类疾病的发生和发展过程，可通过促进AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞功能损伤，参与高血压的发生[5]。敲除其表达，可改善抑郁小鼠星形胶质细胞炎症损伤[12-13]。本研究结果显示，采用circHIPK2 siRNA下调AngⅡ诱导的HUVEC中circHIPK2表达，可减少ROS和促炎性细胞因子生成和释放，抑制炎症和氧化应激，提高AngⅡ诱导的HUVEC中细胞活力、线粒体膜电位，并抑制其凋亡，最终起到明显的内皮细胞保护作用。
miR-7-5p可通过调控炎症和氧化应激反应参与血管损伤过程，增强其表达可通过抑制炎症信号激活而减弱血管损伤[14]。TCF4作为miR-7-5p的下游靶基因[10]，可参与诱导缺氧情况下肺动脉高压的发生[9]，降低其表达可抑制H2O2诱导的人肾小管上皮细胞凋亡[15]。本研究结果显示，采用circHIPK2 siRNA下调AngⅡ诱导的HUVEC中circHIPK2表达，可升高细胞miR-7-5p表达水平并降低TCF4 mRNA和蛋白表达水平，表明miR-7-5p/TCF4轴参与敲低circHIPK2对AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制过程。联合转染circHIPK2 siRNA和miR-7-5p抑制剂，可减弱单独转染circHIPK2 siRNA对AngⅡ诱导的HUVEC中炎症和氧化应激的抑制作用，削弱其对AngⅡ诱导的HUVEC中细胞活力、线粒体膜电位的提高作用和抗凋亡作用，最终逆转其对内皮细胞的保护作用，揭示敲低circHIPK2抑制AngⅡ诱导的血管内皮细胞凋亡是通过上调miR-7-5p实现的。
综上所述，敲低circHIPK2可通过靶向上调miR-7-5p表达而降低TCF4表达，进而抑制氧化应激和炎症反应，提高AngⅡ诱导的血管内皮细胞活力，减轻其线粒体功能损伤和凋亡，最终发挥明显的内皮细胞保护作用。本研究为高血压的临床治疗提供了新的靶点和思路，有利于研发更有效的新型治疗技术和改进现有的治疗技术。
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