多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome，PCOS) 是排卵功能障碍的主要原因，影响全世界约6%~20%的育龄期妇女^[1]。除不孕之外，PCOS的主要特征还包括多囊卵巢、高雄激素血症、高胰岛素血症、慢性无排卵和代谢紊乱等。尽管PCOS的发病机制尚不明确，但颗粒细胞功能障碍被认为是造成PCOS卵泡发育异常的主要原因^[2]。颗粒细胞和卵母细胞处于同一个微环境中，颗粒细胞通过分泌营养物质和激素，参与卵母细胞的减数分裂和成熟。因此，颗粒细胞对卵母细胞成熟和排卵至关重要，颗粒细胞异常增殖或凋亡可能是造成PCOS排卵障碍的根本原因。

转化生长因子(transforming growth factor，TGF) β1是TGF-β超家族的多肽成员，具有多种细胞学功能，参与成熟生物体发育中胚胎的许多细胞过程，包括生长、分化、凋亡、动态平衡等^[3]。TGF-β1是一个在雌性哺乳动物生殖系统中高表达的多功能因子，其表达或功能缺失会导致颗粒细胞转录组变化。SMAD家族蛋白是细胞内重要的TGF-β信号传导和调节分子，可将TGF-β信号由细胞膜直接传导至细胞核内，且不同的SMAD介导不同的TGF-β信号转导。最近的一项研究^[4]证实，依赖SMAD4核转录活性和配体依赖性途径是TGF-β1调控卵巢颗粒细胞转录组变化的普遍机制。然而，SMAD4蛋白在PCOS颗粒细胞增殖和凋亡中的调控作用目前仍不清楚。本研究探讨了SMAD4在PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中的功能，及其作为临床治疗PCOS排卵障碍分子靶点的潜力。

1 材料与方法 1.1 实验动物和试剂

SD大鼠，购自锦州医科大学实验动物中心，所有动物实验方案获得锦州医科大学实验动物伦理委员会批准(编号：2022121201)。

脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNA提取试剂盒，购自哈尔滨新海基因检测有限公司；逆转录试剂盒和实时定量PCR扩增试剂盒，购自宝日医生物技术(北京) 有限公司；组织蛋白提取试剂盒，购自上海贝博生物科技有限公司；兔抗鼠GAPDH单克隆一抗，购自南京巴傲得生物科技有限公司；兔抗鼠Smad4、BAX单克隆一抗，购自艾博抗(上海) 贸易有限公司；兔抗鼠PCNA多克隆一抗，购自沈阳万类生物科技有限公司，FSHR多克隆一抗、Cy3山羊抗兔二抗，购自美国爱博泰克生物科技有限公司；BCA试剂盒、ECL发光液，购自北京兰杰柯科技有限公司；CCK-8试剂盒、DMEM/F12培养基，购自武汉塞维尔生物科技有限公司；干扰小RNA (small interfering RNA，siRNA)，购自湖州河马生物科技有限公司；转染试剂CALNPTM RNAi in vitro，购自北京多纳医药科技有限公司；胎牛血清，购自以色列Biological Industries公司。

1.2 方法

1.2.1 PCOS模型构建

选取3周龄雌性SD大鼠54只，随机分为PCOS组和对照组，每组27只。PCOS组采用DHEA法构建^[5]PCOS大鼠模型，大鼠每日注射0.2 mL芝麻油+DHEA (6 mg/100 g)，对照组大鼠注射等量芝麻油，连续注射20 d。

1.2.2 细胞提取和培养

用颈椎脱臼法处死大鼠，收集卵巢。PBS清洗后剔除脂肪和结缔组织，转移到培养基中，刺破卵泡。加入1 mL胰酶，37 ℃孵育30 min。使用40 µm过滤筛孔过滤，离心后弃上清，加入红细胞裂解液吹打悬浮，静置5 min后离心。加入完全培养基(DMEM/F12+10%胎牛血清+2%青链霉素) 吹打悬浮，接种在培养皿中，37 ℃、5%CO₂培养箱中孵育，48 h换液。

1.2.3 HE染色

卵巢组织固定、脱水、石蜡包埋，切片厚度为5 μm，进行HE染色。光学显微镜下观察和拍照。

1.2.4 免疫荧光染色

将颗粒细胞接种于24孔板中，细胞生长至60%时，室温固定、封闭，FSHR一抗、荧光二抗孵育。加入DAPI溶液，荧光显微镜下观察和拍照。细胞表达阳性率(%) =FSHR阳性细胞数/总细胞数×100，表达阳性率 > 95%时进行下述实验。

1.2.5 siRNA干扰

将密度为3×10⁵/mL的PCOS大鼠卵巢颗粒细胞悬液分为PCOS+si-SMAD4和PCOS+si-scramble组，接种于培养板中，生长至70%后，分别转染siRNA和阴性对照(10 nmol/L)。37 ℃培养箱中孵育，24 h测定mRNA水平，48 h测定蛋白水平和细胞增殖情况。转染siRNA序列，正向5’-GGUUCAC AAUGAGCUUGCAUUTT-3’，反向5’-AAUGCAAGCU CAUUGUGAACCTT-3’。

1.2.6 Western blotting

收集PCOS组和对照组、PCOS+ si-SMAD4组和PCOS+si-scramble组细胞并提取蛋白，经电泳、转膜至PVDF膜上，室温封闭2 h。SMAD4、PCNA、BAX、BCL-2蛋白抗体作为一抗，4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育1 h。化学发光成像仪拍照。

1.2.7 实时定量PCR

使用RNA提取试剂盒提取PCOS组和对照组、PCOS+si-SMAD4组和PCOS+si-scramble组总RNA。按照说明书进行逆转录、扩增。引物序列：SMAD4，正向5’-CAGCCAGGACAGCA GCAGAATG-3’，反向5’-CAGGAGCAGGATGATTG GAAATGGG-3’；GAPDH，正向5’-ACTCCCATTCTT CCACCTTTG-3’，反向5’-CCCTGTTGCTGTAGCCAT ATT-3’。

1.2.8 CCK-8实验

设置空白孔和样本孔，将PCOS+si-SMAD4组和PCOS+si-scramble组颗粒细胞接种并培养于96孔板中。每孔加入10 µL CCK-8溶液，37 ℃避光孵育1 h，酶标仪测定光密度值，波长为450 nm。

1.3 统计学分析

采用GraphPad Prism 9.5对数据进行统计学分析。计量资料用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，2组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 PCOS大鼠模型鉴定

大鼠卵巢组织HE染色结果(图 1)显示，与对照组比较，PCOS组大鼠卵巢闭锁卵泡和囊性卵泡增多，颗粒细胞层数、黄体数明显减少，提示PCOS大鼠模型构建成功。

2.2 大鼠卵巢颗粒细胞鉴定

FSHR在颗粒细胞中特性异表达，FSHR阳性染色定位于细胞质，呈红色荧光染色，DAPI染核呈深蓝色，表达阳性率 > 95%，可进行后续实验(图 2)。

2.3 PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中SMAD4表达水平

实时定量PCR结果(图 3A)显示，PCOS组大鼠卵巢颗粒细胞中SMAD4 mRNA表达水平升高(P < 0.05)。Western blotting结果(图 3B)显示，与对照组相比，PCOS组大鼠卵巢颗粒细胞中SMAD4蛋白表达水平升高(P < 0.05)。

2.4 转染siRNA对大鼠卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

实时定量PCR结果显示，siRNA显著降低PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中SMAD4 mRNA表达水平。Western blotting结果显示，siRNA显著降低PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中SMAD4蛋白表达水平，PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中PCNA、BCL-2蛋白表达水平升高，BAX蛋白表达水平降低。siRNA可促进颗粒细胞的增殖(图 4)。

3 讨论

PCOS是一种病因不明的异质性疾病，是引起女性排卵障碍性不孕、月经失调和高雄激素的重要原因^[6]。PCOS的发病基础是卵泡的程序化发育发生改变，即窦前卵泡生成过多和窦卵泡发育停滞。卵泡发育成熟是卵子发育成受精胚胎的必然条件，颗粒细胞作为卵泡内最大的功能细胞群，其增殖和分化直接影响卵泡发育，其凋亡异常可能是PCOS发病的主要原因^[7]。本研究采用DHEA法诱导SD大鼠，成功构建PCOS大鼠模型，体外分离、鉴定大鼠卵巢颗粒细胞，探讨PCOS大鼠卵巢颗粒细胞发育障碍的可能机制。

TGF-β是一种多效性细胞因子，可以调节细胞生长、分化、细胞外基质重构、上皮-间质转化等^[8]。已发现哺乳动物中TGF-β家族包括3种不同的亚型(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)，它们的序列和结构具有较高的相似性，在体内也具有相似的生物功能，其中TGF-β1在各种组织中的表达水平、生物活性较好。SMAD4基因编码的蛋白属于SMAD家族，目前已知的SMAD蛋白至少有9种，其中SMAD4为唯一的共同介质，是TGF-β信号的重要胞质内信号级联分子。SMAD4可以自身形成同源复合物或与其他的激活型Smad家族成员形成异源复合物，转移到细胞核内，与其他转录因子协同作用，调节TGF-β应答基因的转录。本研究体外培养PCOS大鼠卵巢颗粒细胞，结果发现，PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中SMAD4基因表达水平明显高于正常大鼠。

既往研究^[9]发现，SMAD4表达水平降低可使TGF-β介导的信号通路转录调控障碍。在体外培养的猪颗粒细胞中，SMAD4过表达会促进颗粒细胞增殖^[10]，SMAD4可激活Wnt信号通路，抑制猪颗粒细胞凋亡^[11]。在敲除SMAD4基因的小鼠模型中，TGF-β1信号的敏感性降低^[12]。研究^[13]证实，SMAD4和SMAD4依赖性TGF-β信号通路与卵泡闭锁有关。另有研究^[14]发现，敲低SMAD4可以显著延长人颗粒细胞的细胞周期，抑制凋亡。以上研究均提示，SMAD4基因表达与颗粒细胞增殖、凋亡有关。为了进一步验证SMAD4基因过表达是否与PCOS大鼠卵巢颗粒细胞增殖、凋亡相关，本研究采用siRNA干扰SMAD4基因表达，结果发现，敲低SMAD4后PCOS大鼠卵巢颗粒细胞中PCNA、BCL-2蛋白表达水平升高，BAX蛋白表达水平降低。提示敲低SAMD4可促进PCOS大鼠卵巢颗粒细胞增殖，抑制凋亡。

综上所述，本研究发现PCOS大鼠卵巢颗粒细胞发育障碍可能与SMAD4基因过表达有关，SMAD4有望成为治疗PCOS患者排卵障碍的潜在靶点。但SMAD4基因调控PCOS大鼠卵巢颗粒细胞发育障碍的具体机制尚不清楚，需要更多的动物和细胞实验证实。