肺癌是全球发病率和死亡率最高的癌症，占所有癌症总发病率的11.4%和死亡病例的18.0%^[1]。终末期肺癌临床疗效有限，且容易出现耐药^[2]。目前，肿瘤免疫疗法已成为研究热点。肿瘤可通过免疫检查点抑制免疫细胞的杀伤功能，实现免疫逃逸^[3]。而免疫检查点抑制剂则通过阻断其与免疫细胞的相互作用，恢复T细胞功能并维持抗肿瘤免疫应答，实现抗肿瘤免疫治疗的目的^[4]。主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ类分子是细胞免疫应答的重要分子，能将细胞内源性抗原肽呈递给CD8⁺ T细胞，激活其细胞毒作用，清除感染或恶变细胞^[5]。但许多恶性肿瘤细胞中MHC Ⅰ表达下调或缺失，成为免疫逃逸的方式之一 ^[6]。因此，恢复MHC Ⅰ表达可能有助于提高免疫治疗的效果。

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样因子2（tumor necrosis factor α-induced protein-8-like factor 2，TIPE2）为TIPE家族成员，参与细胞凋亡、炎症和免疫稳态的调控，在包括肺癌在内的多种肿瘤中表达下调^[7]。研究^[8]发现，TIPE2过表达可促进T细胞和NK细胞介导的抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤的发展和转移。但其在肺癌中的免疫调控机制尚未明确。本研究通过构建TIPE2过表达的人肺癌细胞系A549并与CD8⁺ T细胞共培养，探讨TIPE2对MHC Ⅰ表达及CD8⁺ T细胞介导杀伤作用的影响及其分子机制。

1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂

人肺癌细胞系A549购自武汉益普生物科技有限公司，胎牛血清购于浙江天杭生物科技公司，DMEM培养基购自美国Corning公司，LV-TIPE2及阴性对照LV-NC慢病毒由江苏金斯瑞生物科技有限公司构建，TRIzol试剂盒购自南京诺唯赞生物科技公司，Quant cDNA第一链合成试剂盒和Talent荧光定量检测试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，RIPA裂解液购自上海吉至生化科技有限公司，BCA蛋白浓度定量试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，ECL购自广州博鹭腾生物科技有限公司，TritonX-100和γ干扰素（interferon-γ，INF-γ）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF‐α）ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，DAPI和MTT试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，外周血单核细胞分离试剂盒购自上海吉至生化科技有限公司，CD8磁珠抗体购自美国Proteintech公司，Annexin V-FITC/PI检测试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司。TIPE2抗体、MHC Ⅰ抗体及山羊抗兔IgG抗体购自英国abcam公司，CD8抗体购自美国eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌细胞培养与转染

在A549细胞中添加含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO₂培养箱中常规培养。待其生长到80%左右，以2×10⁵/孔接种至24孔板，第2天，在每孔中加入LV-NC、LV-TIPE2慢病毒液（感染复数=20），分别记为LV-NC组、LV-TIPE2组，以未转染的A549细胞作为对照组。12 h后更换为新鲜培养基，继续培养72 h后用嘌呤霉素进行筛选。通过实时定量PCR和Western blotting验证细胞是否过表达TIPE2。

1.2.2 实时定量PCR检测肺癌细胞中TIPE2 mRNA表达

取未感染和感染LV-NC、LV-TIPE2后的A549细胞，采用TRIzol法从细胞中分离总RNA，测定其浓度和纯度。按照反转录试剂盒说明书操作合成cDNA。Oligo 7.60软件设计引物序列如下：TIPE2，正向5’-ACTGAGTAAGATGGCGGGTCG-3’，反向5’-TTCTGGCGAAAGCGGGTAG-3’；β-actin，正向5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，反向5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。采用Talent荧光定量检测试剂盒进行实时定量PCR，配制反应体系：2×Talent qPCR PreMix12.5 μL、上下游引物各0.75 μL、cDNA模板1 μL、50×ROX Reference Dye 0.5 μL、无酶水补足25 μL，在ABI 7500 FAST系统上设置两步法反应程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s（40个循环）。以β-actin为内参，采用2^-ΔΔCt法计算TIPE2 mRNA的相对表达量。

1.2.3 Western blotting检测肺癌细胞中TIPE2、MHC Ⅰ蛋白表达

在未转染及转染LV-NC、LV-TIPE2的A549细胞中加入RIPA，分离总蛋白，BCA法测定浓度。蛋白加热变性，取40 μg经电泳分离蛋白，转PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗TIPE2多克隆抗体（1∶1 000）、兔抗MHC Ⅰ多克隆抗体（1∶1 000），4 ℃摇床孵育过夜。加入抗生素标记的山羊抗兔IgG抗体（1∶5 000），室温摇床孵育1 h，ECL显色，观察蛋白条带，ImageJ软件分析条带灰度值，以GAPDH为内参对目的蛋白灰度值进行量化。

1.2.4 细胞免疫荧光染色观察肺癌细胞中MHC Ⅰ表达

未转染及转染LV-NC、LV-TIPE2后的A549细胞进行爬片，4%多聚甲醛覆盖固定后，0.5%TritonX-100渗透10 min，浸入10%山羊血清中封闭1 h。配置一抗，滴加兔抗MHC Ⅰ多克隆抗体（1∶200）覆盖细胞，锡纸包裹后于4℃孵育过夜。配置荧光二抗，滴加Alexa Fluor标记山羊抗兔IgG抗体（1∶500），室温孵育1 h，DAPI染核，抗荧光淬灭剂封片，晾干，荧光共聚焦显微镜观察着色情况并拍照。

1.2.5 CD8⁺ T细胞分离与鉴定

经患者知情同意，且经许昌市中心医院伦理委员会审核批准，抽取在许昌市中心医院进行体检的健康志愿者外周血15 mL，放入含肝素的离心管内，加入Ficoll分离液提取外周血单核细胞。调整细胞密度至1×10⁷/mL，吸取80 μL悬液，并加20 μL CD8磁珠抗体，混匀后4℃孵育15 min，PBS洗去未结合的磁珠抗体，流式缓冲液重悬细胞。将分选柱置于磁铁上，PBS洗润分选柱，将细胞悬液过柱，重复3遍，取下分选柱，加PBS后立即推出分选柱内液体并收集。取1×10⁵个细胞置于流式管内，分别加入5 µL FITC标记的CD8抗体及同型对照抗体，室温孵育15 min，PBS清洗后重悬，流式细胞仪检测CD8⁺ T细胞表达情况。

1.2.6 肺癌细胞与CD8⁺ T细胞共培养及肿瘤杀伤效果测定

将未转染及转染LV-NC、LV-TIPE2慢病毒的A549细胞分别与CD8⁺ T细胞进行共培养，记为CD8⁺ T+A549组、CD8⁺ T+LV-NC-A549组、CD8⁺ T+LV-TIPE2-A549组。以CD8⁺ T细胞分别作为效应细胞，A549细胞作为靶细胞，依次按照效靶细胞10∶1、20∶1、30∶1的比例加入到96孔培养板内，共培养18 h后，按照MTT试剂盒说明书，测定各孔吸光度值，确定CD8⁺ T细胞对肺癌细胞的杀伤效果。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI双染法检测肺癌细胞凋亡

收集CD8⁺ T+A549组、CD8⁺ T+LV-NC-A549组及CD8⁺ T+LV-TIPE2-A549组的A549细胞，用PBS洗涤，胰蛋白酶消化，吸取100 μL细胞悬液置于流式管，依次加入5 μL Annexin V-FITC与PI，混匀，避光孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。

1.2.8 ELISA检测共培养后上清液中IFN-γ和TNF‐α的分泌水平

收集CD8⁺ T+A549组、CD8⁺ T+LV-NC-A549组及CD8⁺ T+LV-TIPE2-A549组的细胞培养上清液，ELISA法测定上清液中INF‐γ、TNF‐α含量，按照试剂盒说明书操作，并测定吸光度值，根据标准曲线计算INF‐γ和TNF‐α含量。

1.3 统计学分析

采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析，计量资料以x±s表示。多组间数据比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验。采用GraphPad 8.0软件制图。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 3组肺癌细胞中TIPE2表达比较

实时定量PCR结果显示，与对照组（1.00±0.04）和LV-NC组（0.97±0.08）比较，LV-TIPE2组TIPE2 mRNA相对表达量（3.52±0.36）显著上调（P＜0.05）；Western blotting结果显示，与对照组（0.43±0.03）和LV-NC组（0.40±0.04）比较，LV-TIPE2组TIPE2蛋白相对表达量（1.15±0.13）显著上调（P＜0.05）。见图 1。

2.2 3组肺癌细胞中MHC Ⅰ表达比较

Western blotting检测结果显示，与对照组（0.39±0.04）、LV-NC组（0.40±0.03）比较，LV-TIPE2组MHC Ⅰ蛋白相对表达量（1.18±0.12）显著上调（P＜0.05）。见图 2。

细胞免疫荧光染色显示，与对照组和LV-NC组比较，LV-TIPE2组A549细胞表面MHC Ⅰ荧光强度明显增强。见图 3。

2.3 CD8⁺ T细胞鉴定结果

流式细胞术检测结果显示，磁珠分选的CD8⁺ T细胞阳性率 > 90.0%。见图 4。

2.4 TIPE2对CD8⁺ T细胞杀伤肺癌细胞的影响

CD8⁺ T细胞对A549细胞杀伤能力检测结果显示，在同一效靶比（10∶1、20∶1、30∶1）下，CD8⁺ T+LV-TIPE2-A549组CD8⁺ T细胞对A549细胞的杀伤率显著高于CD8⁺ T+A549组和CD8⁺ T+LV-NC-A549组（P＜0.05）。见图 5。

流式细胞术检测结果显示，与CD8⁺ T+A549组（10.81%±1.07%）和CD8⁺ T+LV-NC-A549组（12.64%±1.21%）比较，CD8⁺ T+LV-TIPE2-A549组A549细胞凋亡率（33.63%±3.48%）显著增加（P＜0.05）。见图 6。

ELISA检测结果显示，与CD8⁺ T+A549组（115.67pg/mL±12.03 pg/mL、142.72 pg/mL±14.66 pg/mL）和CD8⁺ T+LV-NC-A549组（117.30 pg/mL±12.34 pg/mL、144.09 pg/mL±15.16 pg/mL）比较，CD8⁺ T+LV-TIPE2-A549组上清液中IFN-γ（175.54 pg/mL±18.02 pg/mL）和TNF‐α（198.78 pg/mL±20.46 pg/mL）含量显著增加（均P＜0.05）。

3 讨论

在癌症进展过程中，肿瘤细胞可通过多种机制逃避免疫监视，其中免疫检查点抑制信号通路是关键途径之一。阻断免疫检查点可增强免疫系统识别和攻击肿瘤细胞的能力，目前程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD-1）/程序性细胞死亡配体1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）抑制剂已被批准用于晚期肺癌治疗^[9]。然而，受益患者有限且伴有免疫相关不良反应。研究^[10]表明，肿瘤微环境中免疫细胞与肿瘤细胞之间的动态串扰决定了免疫状态，从而影响免疫检查点抑制剂的疗效。CD8⁺ T细胞通过识别MHC Ⅰ类分子呈递的肿瘤抗原，在抗肿瘤免疫中发挥关键作用，其杀伤功能的维持或增强是当前研究的重点。

TIPE2在多种肿瘤中表现异常，并具有重要的免疫调控作用。下咽鳞状细胞癌中TIPE2低表达与患者不良预后相关，过表达其可抑制细胞增殖和迁移并促进凋亡^[11]。胰腺癌相关研究^[12]显示，TIPE2在早期表达升高但随肿瘤进展而下降，其过表达能下调Survivin表达、激活半胱氨酸蛋白酶3/7，抑制细胞增殖并促进凋亡。TIPE2作为免疫稳态的调节因子，在免疫细胞中同样发挥重要作用。研究^[13]表明NK细胞中TIPE2缺失不仅能增强NK细胞自身的抗肿瘤活性，还可以间接提升CD8⁺ T细胞活性及功能。ZHANG等 ^[8]研究发现，在乳腺癌细胞中过表达TIPE2不仅抑制乳腺癌的生长和转移，还能增加CD8⁺ T细胞和NK细胞数量，并增强其毒性功能。FENG等^[14]报道，TIPE2通过抑制转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）相关通路抑制胰腺癌增殖和转移，并通过促进T细胞活化来发挥抗肿瘤作用。本研究同样发现，在A549细胞中过表达TIPE2后再与CD8⁺ T细胞共培养，CD8⁺ T细胞对A549细胞的杀伤作用增强，A549细胞凋亡率增加，促进CD8⁺ T细胞分泌IFN-γ和TNF-α，提示在肺癌微环境中提高TIPE2表达能够增强CD8⁺ T细胞的杀伤作用。

CD8⁺ T细胞的有效激活依赖于肿瘤抗原的呈递，抗原缺失或呈递障碍是导致免疫应答失败的重要原因。肿瘤发生早期，MHC Ⅰ类分子可将抗原递呈至细胞表面，介导CD8⁺ T细胞识别并发挥细胞毒作用；但在肿瘤进展过程中，MHC Ⅰ类分子表达减少，抗原呈递功能受损，从而削弱CD8⁺ T细胞的识别与杀伤能力，促进肿瘤免疫逃逸。已有研究^[15]表明，干预特定信号通路可恢复MHC Ⅰ类分子表达并增强免疫效应，如抑制PIKfyve脂质激酶可通过阻断自噬通量上调MHC Ⅰ表达，增强CD8⁺ T细胞杀伤力；组蛋白乙酰转移酶p300/CBP和核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）的激活也可促进MHC Ⅰ表达和抗原呈递，激活CD8⁺ T细胞并增强化疗药物对肿瘤细胞的毒性作用^[16]。本研究结果显示，在A549细胞中过表达TIPE2可增加MHC Ⅰ蛋白表达和细胞表面荧光强度，结合其对CD8⁺ T细胞杀伤A549细胞的促进作用，提示TIPE2可能通过促进MHC Ⅰ表达增强CD8⁺ T细胞的抗肿瘤功能。

综上所述，在肺癌细胞中过表达TIPE2能够上调MHC Ⅰ表达，增强CD8⁺ T细胞介导的杀伤作用，从而抑制肺癌的发生与进展，提示TIPE2可能成为肺癌免疫治疗的新靶点。然而，本研究结果仍需在动物模型中进一步验证，并深入探索TIPE2调控MHC Ⅰ表达的具体分子机制，为肺癌免疫治疗提供理论依据和新思路。