宫颈癌是导致女性死亡的主要癌症之一^[1-3]。调查显示，每年约有5万名妇女因宫颈癌死亡，其中近90%发生在发展中国家^[4-5]。宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是宫颈癌的癌前病变，其发生、发展与人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染密切相关^[6]。大多数HPV感染在短期内可被免疫系统清除，但仍有部分高危亚型会发生免疫逃逸，导致慢性感染，引起宫颈上皮的不典型增生，进而发展成CIN，最终可能演化成宫颈癌^[7]。因此，寻找更精确的生物标志物，以预测CIN的发生和进展以及与CIN相关的宫颈癌风险，具有至关重要的意义。P16^INK4a是一个关键的细胞周期调控蛋白，其异常表达与多种肿瘤的发生和发展密切相关^[8-9]。研究^[10]发现，P16^INK4a的过度表达是CIN的一个标志，可能与宫颈癌的发生有关。目前关于P16^INK4a与HPV相关性的研究报道有限，因此，本研究拟探讨P16^INK4a与HPV感染及CIN的相关性，以期为防治宫颈癌提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 一般资料

选取2020年2月至2023年5月在我院就诊的CIN患者197例作为CIN组，其中CIN1 62例，CIN2 89例，CIN3 46例。纳入标准：经术后病理确诊为CIN；术前未接受激素、免疫治疗等；临床资料保存完整。排除标准：有HPV疫苗接种史；合并心、肝、肺等重要脏器疾病；患其他恶性肿瘤；既往有子宫手术史。同时选取接受子宫全切除术且术后病理证实宫颈组织正常的患者50例作为对照组。本研究获得我院医学伦理委员会批准[k（2020）201]。所有患者知情同意。

1.2 研究方法

取CIN患者的宫颈组织，用EDTA抗原进行微波修复后，置于3%过氧化氢甲醇溶液中孵育；10%正常山羊血清封闭；加入一抗鼠抗人P16^INK4a单抗（美国Santa Cruz公司），4 ℃孵育12 h后滴加增强剂，37 ℃下孵育20 min；滴加二抗（南京凯基生物科技有限公司），37 ℃孵育30 min；DAB显色；光学显微镜下观察。使用阳性组织切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。根据P16^INK4a在细胞中的反应强度判断表达情况：强阳性（+++），细胞弥漫黄褐色着色；阳性（++），较弥漫或大片状棕黄色着色；弱阳性（+），小片状或灶性反应；阴性（-），组织细胞无着色。计算阳性表达率，阳性表达率（%）=非阴性患者数/该组患者总数×100。

观察各组P16^INK4a阳性表达率和HPV感染率，比较CIN各组有和无HPV感染患者P16^INK4a阳性表达率，以及不同临床特征CIN患者P16^INK4a阳性表达率、HPV感染率差异。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件行统计学分析。计量资料用 x±s表示，采用方差分析比较组间差异；计数资料用n（%）表示，采用χ²检验或Fisher精确概率法比较组间差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组一般资料比较

各组患者一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。见表 1。

2.2 各组P16^INK4a阳性表达率比较

对照组P16^INK4a阳性表达率和HPV感染率明显低于CIN组患者（P < 0.05）；CIN2与CIN3患者P16^INK4a阳性表达率明显高于CIN1患者（P < 0.05）；CIN3患者HPV感染率高于CIN1与CIN2患者（P < 0.05）；CIN1与CIN2患者HPV感染率比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 2。

2.3 CIN患者HPV感染与P16^INK4a阳性表达的关系

有HPV感染的CIN患者P16^INK4a阳性表达率为93.33%（84/90），明显高于无HPV感染的CIN患者[54.21%（58/107）]，差异有统计学意义（χ²=37.189，P < 0.05）；CIN1、CIN2、CIN3伴HPV感染患者P16^INK4a阳性表达率均明显高于不伴HPV感染患者（P < 0.05）；CIN1、CIN2、CIN3伴HPV感染患者P16^INK4a阳性表达率比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表 3。

2.4 不同亚型HPV感染患者P16^INK4a阳性表达率比较

Fisher精确概率法分析结果显示，HPV16/18感染患者P16^INK4a阳性表达率（50/50，100%）明显高于HPV31/33/53（34/40，85%）感染患者，差异有统计学意义（P = 0.006）。

2.5 不同临床特征CIN患者P16^INK4a阳性表达率、HPV感染率比较

不同年龄、体重指数、是否绝经及高血压、糖尿病、吸烟、饮酒CIN患者P16^INK4a阳性表达率、HPV感染率比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表 4。

3 讨论

宫颈上皮HPV感染可引起CIN，甚至发展为宫颈癌^[11]。HPV感染与CIN的具体发病机制目前尚未完全明确。HPV是一种DNA病毒，某些高危亚型HPV感染后，可进入宫颈上皮细胞，并将自身DNA整合至宿主细胞DNA中，从而在细胞内进行病毒复制。HPV DNA的整合会导致宫颈上皮细胞中基因突变，从而破坏细胞正常的调控机制，致使细胞发生不受控制的分裂和增殖^[12-13]。此外，HPV感染还可引起宫颈上皮细胞转化，失去正常细胞特征，发生CIN。若不及时干预，可能发展为宫颈癌^[14]。为进一步探究HPV感染患者CIN进展的相关机制，本研究对比了不同CIN分级患者P16^INK4a表达及HPV感染情况，分析P16^INK4a与HPV感染以及CIN进展之间的关联，以期为预防和治疗宫颈癌提供科学依据。

P16^INK4a是一种抑制细胞增殖的蛋白，其主要功能是调控细胞周期，通过抑制细胞周期依赖性激酶的活性，诱导细胞从G₁期进入S期停滞，从而控制细胞的增殖^[15-16]。而在CIN中，由于宫颈上皮受到损害，细胞可能过度表达P16^INK4a作为一种自我保护反应，以抑制异常细胞生长。CIN分级越高，宫颈上皮受损程度越重，细胞周期可能受到的扰乱也越严重，负反馈导致P16^INK4a过度表达，以抑制异常细胞增殖。

本研究结果显示，对照组P16^INK4a阳性表达率明显低于CIN1、CIN2和CIN3患者；CIN2和CIN3患者P16^INK4a阳性表达率明显高于CIN1患者。说明CIN患者P16^INK4a表达率升高，且与病变程度相关。这与戈文舜等^[17]的研究结果一致。

RB蛋白是肿瘤抑制蛋白，在细胞周期调控中起着关键作用^[18]。当RB蛋白处于活跃状态时，可结合并抑制E2F转录因子，阻止E2F引导细胞进入S期，从而控制细胞的增殖^[19]。HPV病毒中具有编码HPVE7蛋白的基因，HPVE7蛋白的一个重要功能是与RB蛋白相互作用并使其失活。这种作用导致RB蛋白的解离，使E2F转录因子释放，允许细胞进入S期并进行DNA复制^[20]。这是HPVE7蛋白在HPV阳性宫颈癌发展中的关键作用之一。HPVE7蛋白表达导致RB蛋白失活后，细胞为了对抗异常细胞增殖和癌症发展，通常会过度表达P16^INK4a，以应对RB蛋白失活导致的细胞异常增殖。因此，合并HPV感染会进一步促进P16^INK4a的表达。本研究结果显示，有HPV感染的CIN患者P16^INK4a阳性表达率明显高于无HPV感染的CIN患者；CIN1、CIN2和CIN3伴HPV感染患者P16^INK4a阳性表达率明显高于不伴HPV感染患者。说明P16^INK4a表达与HPV感染有显著关系。

本研究还发现，HPV16/18感染患者P16^INK4a阳性表达率明显高于HPV31/33/53感染患者。兰晓卉等^[21]的研究表明P16^INK4a免疫细胞化学染色在不同HPV亚型中的表达率不同，且对HPV阳性患者具有较好的分流效能。宋艳等^[22]的研究也表明P16^INK4a蛋白在不同HPV亚型表达存在差异，在HPV16中表达显著升高。本研究结果中，P16^INK4a在不同的HPV亚型中表达不同，可能与不同类型HPV感染导致RB磷酸化的方式不同有关，其具体机制仍需进一步研究证实。

HPV是一种常见的性传播病毒，性传播是其最主要的感染途径，且大部分CIN患者均可检测出HPV阳性。本研究结果显示，不同年龄、体重指数以及是否绝经、高血压、糖尿病、吸烟及饮酒对CIN患者HPV感染率无显著影响。但是，HPV感染导致CIN的发生是一个长期慢性的过程，本研究未充分考虑患者的HPV感染时间，可能对研究结果有一定影响。

综上所述，本研究发现，CIN患者P16^INK4a表达率明显升高，且与病变程度相关，同时，P16^INK4a表达与HPV感染有显著关系。