脑卒中是导致全球死亡的主要原因之一，缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）占所有卒中病例的62.4%^[1]。神经损伤和心血管并发症为IS的常见死因^[2]。1947年，BYER等^[3]首次报道脑血管疾病可引起心肌损伤和心律失常。急性脑缺血可诱发心律失常、充血性心力衰竭、心脏骤停和心房颤动等异常表现，甚至导致死亡。然而，卒中导致的心肌损伤、微循环障碍等多个病理机制尚未完全阐明，且临床上缺乏有效的诊断方法和预防措施，因此，探讨卒中后心脏并发症的分子机制，对实现其早期诊断和治疗有重要意义。

生物信息学通过结合生物学与计算科学，在揭示疾病的分子机制中发挥重要作用。本研究基于基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）数据库，通过生物信息学方法，初步筛选出急性IS后心功能不全发生过程中的差异表达基因（differential expressed genes，DEG），为卒中后心功能不全的发生机制提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 数据下载和整理

从GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下载急性IS后心脏组织数据集GSE102558。其中大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）组和假手术组各6个样本。

1.2 DEG筛选

采用R语言devtools包进行主成分分析（principal components analysis，PCA）；Limma包对数据进行差异表达分析，P < 0.05且|log₂FC| > 0.6作为DEG筛选标准。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建及关键基因筛选

利用String网站（http://www.string-db.org/）对DEG进行分析，以中度置信度0.4作为显著标准，获得PPI结果。Cytoscape 3.9.0软件的MCODE插件对PPI网络进行功能模块分析。选择Cytohubba插件中的MCC算法，筛选评分前10位的核心基因。

1.4 DEG的基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

GO富集包含生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。KEGG则在分子通路水平研究特定的生物进程。使用DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行GO和KEGG富集分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.5 MCAO模型建立

6~8周SPF级C57B/6J雄性小鼠，体重20~25 g，购自山西医科大学实验动物中心。本研究获得山西医科大学第二医院伦理委员会审查（伦理备案号：DW2023019）。MCHO组采用1%戊巴比妥钠（80 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，仰卧位固定。颈部备皮消毒后颈正中切口，分离左侧颈总、颈外及颈内动脉，结扎颈外、颈总动脉并在颈总动脉远端三角分叉处打一活结，微动脉夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉剪口，将线栓（北京西浓，1620A4）插入颈总动脉后松开颈内动脉夹，沿颈内动脉插入，有明显阻力时停止，固定线栓。缺血1 h后，拔出线栓，恢复血供，缝合伤口，于造模24 h后取心脏组织，与数据集模型一致。假手术组按上述操作进行，但不置入线栓。

1.6 神经功能评分

再灌注24 h后，使用经改良后的Longa神经功能学评分^[4]评估模型成功率，排除无明显异常活动行为、无自主活动可伴有意识障碍或死亡的小鼠。

1.7 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色测定梗死体积

再灌注24 h给予过量麻醉小鼠后，取出大脑，-20 ℃冷冻20 min，2 mm厚度行冠状切片。2% TTC溶液，37 ℃孵育30 min。染色结束用4%多聚甲醛固定后拍照，正常组织呈红色，梗死区呈灰白色。使用Image J计算梗死面积。

1.8 超声心动图

超声心动图检查小鼠急性IS 24 h后心功能情况。使用GE Vivid 7-Dimension超声仪M模式成像获得左心室胸骨旁短轴视图。统计左心室缩短分数（frac-tional shortening，FS）、射血分数（ejection fraction，EF）、左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVIDd）和左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVIDs）。

1.9 实时PCR验证关键基因表达

按照聚合美M5 RNA快速提取试剂盒说明书提取小鼠心脏组织RNA，用紫外分光光度计测量RNA的浓度及纯度。聚合美M5反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA后，使用2x Realtime PCR Super mix试剂盒进行基因表达检测。以β-actin为内参，2^-ΔΔCt相对定量法分析待测基因的转录水平。所用引物序列见表 1。

1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0.2软件进行数据统计学处理以绘图，数据以x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MCAO小鼠24 h后心脏组织DEG表达情况

PCA结果显示，2组样本间有明显的群体偏差聚类，见图 1A。GSE102558数据集DEG分析结果显示，共有739个DEG，其中上调基因385个，下调基因354个。DEG火山图及热图见图 1B、1C。排名前10位的上调基因及下调基因见表 2、3。

2.2 PPI构建及关键基因的筛选

筛选出的DEG在String网站上分析，获得PPI网络。使用MCODE插件对PPI网络进行功能模块筛选，见图 2。

Cytoscape软件对PPI网络进行拓扑分析，筛选评分前10位的核心基因，分别为Col1a1、Col1a2、Col3a1、Fbn1、Postn、Col5a1、Mmp3、Eln、Acta2、Timp3，见图 3。

2.3 GO富集分析和KEGG通路分析

DAVID数据库对排名前3位的功能模块和核心基因GO和KEGG分析结果显示，模块1的基因主要在蛋白质消化吸收、胶原纤维组织、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的相互作用等富集（图 4A）；模块2的基因主要涉及核糖体的加工和处理、细胞质翻译等（图 4B）；模块3的基因主要富集在脂质消化与吸收、脂质颗粒、PPAR信号通路等（图 4C）。

MCC算法筛选出的前10位核心基因，其BP主要富集在细胞外基质、胶原纤维组织、血管发育等，CC主要在细胞外基质细胞外间隙、胶原三聚体、基底膜等，MF主要涉及细胞外基质结构成分、血小板衍生生长因子结合、细胞外基质结构性成分赋予拉伸强度、蛋白酶结合，KEGG主要富集在蛋白质消化和吸收、松弛素通路、AGE-RAGE通路在糖尿病并发症中的作用等通路，见图 5。

为了进一步缩小核心基因的范围，MCC前10位的基因与DEG中上调和下调倍数最高的20个基因求取交集，筛选出Col3a1、Postn 2个核心基因，在MCAO小鼠心脏组织中表达均下调。

2.4 神经功能学评分和TTC染色评估MCAO模型

TTC染色结果显示，MCAO组梗死体积明显增加，MCAO模型构建成功（图 6A、6B）。Longa神经行为学评分显示，与假手术组比较，MCAO组神经功能评分显著增高，有统计学差异（P < 0.05，图 6C）。

2.5 急性IS对心功能的影响

采用超声心动图来评估心功能。结果显示，与假手术组相比，MCAO组LVFS和LVEF均有所下降，差异有统计学意义（P < 0.05）。MCAO组的LVIDs高于假手术组（P < 0.05）。2组的LVIDd比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。提示急性IS后心功能下降。见图 7。

2.6 实时PCR验证核心基因的表达

采用实时PCR技术检测2组心脏组织中关键基因的表达。结果显示，Postn和Col3a1在MCAO组心脏组织中表达显著低于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05），PCR结果与生物信息分析结果一致，见图 8。

3 讨论

本研究通过GEO数据库筛选出急性IS后心脏组织评分前10的核心基因，分别为Col1a1、Col1a2、Col3a1、Fbn1、Postn、Col5a1、Mmp3、Eln、Acta2、Timp3。富集分析结果显示，DEG主要在含有胶原蛋白的细胞外基质、胶原纤维组织中显著富集，可见胶原蛋白以及细胞外基质在IS后心功能不全的发病进程中发挥重要作用。结合DEG中上调和下调倍数最高的20个基因，筛选出Col3a1、Postn 2个核心基因，其表达在MCAO小鼠心脏组织中均下调。

Col3a1基因编码的Ⅲ型胶原蛋白，是一种细胞外基质蛋白^[5]。Ⅲ型胶原蛋白是血管的重要结构成分，并为许多器官提供抗拉强度和完整性。胶原蛋白作为ECM的主要成分，当其表达增加时，ECM过度积累导致组织纤维化。研究^[6-7]表明，ECM沉积可导致心肌僵硬，增加心律失常风险，破坏心肌细胞间耦合，导致心功能下降和心力衰竭。心肌损伤（如心肌梗死）可导致Col5a1与Col1a1或Col3a1的表达增加。在心肌梗死或高血压性心肌纤维化早期，Ⅲ型胶原较Ⅰ型胶原先沉积。研究^[8]发现，抑制心脏成纤维细胞中β-catenin的功能，可降低Col1a1、Col3a1和Postn基因表达，减轻心肌肥厚。表明Col3a1的表达失调可对心脏功能产生影响。

Postn基因编码骨膜蛋白，是一种分泌的细胞外基质蛋白，参与细胞黏附和胶原蛋白组织^[9]。研究^[10]发现，Postn参与心脏重构和心肌纤维化。骨膜蛋白与胶原蛋白水平呈正相关。另有研究^[11]表明，小鼠缺失Postn基因虽然可以减少心肌梗死后的纤维化、改善心室功能，但会使心肌成纤维细胞不能完全发挥作用，不能在梗死损伤后产生适当的纤维疤痕，从而增加心室壁破裂风险，降低梗死早期愈合阶段的生存率。

本研究超声心动图结果显示，MCAO组小鼠的LVFS和LVEF均有所下降，表明急性IS后心肌收缩力降低，心功能下降。实时PCR结果显示，MCAO组Col3a1、Postn表达较假手术组降低，与数据集分析结果一致。表明在MCAO缺血左侧脑梗1 h后，ECM及胶原蛋白减少，心脏并未向肥厚和纤维化发展。有研究^[12]表明，小鼠左侧MCAO缺血1 h，表现出心脏重量迅速下降和心肌细胞萎缩，Col3al和Col5a1表达下降。BIEBER等^[13]在MCAO中缺血30 min，术后8周检测心脏只有轻微变化。也有研究^[14]报道右脑局灶性缺血30 min数周后会出现心脏肥厚，并伴有交感神经的过度活动。这种差异是由于脑缺血持续时间和梗死面积大小，以及脑梗死部位不同引起 ^[15]，可能的机制包括岛叶皮质损伤、自主神经失衡、儿茶酚胺激增、心肌离子通道改变、免疫反应和全身炎症反应等^[2]。

综上所述，Col3a1与Postn是急性IS后心功能不全的2个关键基因；Col3a1与Postn可能与急性IS后心功能不全的发展密切相关。