2024, Vol. 53文章信息
- 刘景祎, 李富慧, 宋彦
- LIU Jingyi, LI Fuhui, SONG Yan
- 基于AMPK/SIRT1通路探究苦参碱对阿尔茨海默病Aβ25-35诱导PC12细胞氧化损伤和凋亡的影响
- Effect of matrine on oxidative damage and apoptosis of PC12 cells via AMPE/SIRT1 pathway in Alzheimer disease induced by Aβ25-35
- 中国医科大学学报, 2024, 53(8): 741-746, 751
- Journal of China Medical University, 2024, 53(8): 741-746, 751
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文章历史
- 收稿日期：2023-07-17
- 网络出版时间：2024-07-23 10:17:50
引用本文 |
2. 南阳市第二人民医院神经内科，河南 南阳 473000
2. Neurology Department, Nanyang Second People's Hospital, Nanyang 473000, China
阿尔茨海默病是常见的中枢神经系统疾病，也是导致老年群体认知功能障碍的主要诱因[1]。β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ) 沉积是阿尔茨海默病主要的发病基础，Aβ假说认为Aβ通过漏掉神经细胞，造成周围神经细胞和神经胶质细胞线粒体损伤，进一步诱导机体氧化损伤和炎症反应，促进神经纤维缠结，从而引发阿尔茨海默病[2]。Aβ主要是由淀粉样前体蛋白分解产生，包括无毒Aβ单体、神经毒性Aβ纤维和Aβ寡聚体[3]。研究[4]发现Aβ25-35可刺激PC12细胞损伤，病理表现为凋亡、氧化应激和炎症反应等。
苦参碱是从植物苦参、苦豆子等中药材中分离出的一种生物碱，化学结构属于喹诺嗪类，具有抗心律失常、抗炎、抗病毒、保护神经等药理活性[5]。李运华等[6]研究显示，苦参碱可改善Aβ25-35诱导认知功能障碍小鼠空间记忆能力，还可改善海马神经再生能力，但有关苦参碱对Aβ25-35诱导PC12细胞的影响尚未见报道。AMP活化蛋白激酶(adenosine 5’-monophosphate-activated protein kinase，AMPK) /沉默信息调节因子(silent mating type information regulation 2 homolog1，SIRT1) 通路与神经损伤的保护作用密切相关，已有研究[7]显示，该通路可减轻神经凋亡。本研究基于AMPK/SIRT1通路探究苦参碱对阿尔茨海默病Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡和氧化损伤的影响。
1 材料与方法 1.1 细胞和主要试剂PC12细胞购自中国科学院上海细胞库；苦参碱(货号519-02-8) 购自上海广锐生物；胎牛血清、杜氏改良依格尔培养基(dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM) 培养液购自美国Gibco公司；噻唑蓝(methyl-thiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT) 试剂盒、凋亡试剂盒购自艾美捷科技；Aβ25-35购自上海源叶生物公司；活性氧(reactive oxygen species，ROS) 试剂盒购自北京百奥莱博；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD) 试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px) 试剂盒购自上海梵态生物；白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6) 试剂盒、白细胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β) 试剂盒、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor - α，TNF-α) 试剂盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA) 试剂盒、化学发光试剂购自北京索莱宝；AMPK抗体、p-AMPK抗体、SIRT1抗体、B细胞淋巴瘤/白血病-2 (B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2) 抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax) 抗体、剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3 (cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase-3) 抗体、β-actin抗体购自英国Abcam公司。
1.2 细胞培养PC12细胞接种于培养瓶中，培养基含有10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5% CO2培养瓶中进行培养。每2~3 d换1次细胞液，细胞生长汇合至75%~85%时，加胰酶消化培养。
1.3 MTT法检测细胞增殖取对数生长期PC12细胞，以1×105/mL接种于96孔板中，培养12 h后加入浓度为0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L苦参碱，继续培养24 h、48 h，加入20 μL MTT试剂孵育4 h，然后每孔内添加150 μL二甲基亚砜试剂，轻轻震荡至溶解，置于酶标仪490 nm处检测细胞吸光度(optical density，OD)。
1.4 细胞分组将生长良好的PC12细胞分为Con组、Aβ25-35组、Aβ25-35+Matrine-L组、Aβ25-35+Matrine-M组、Aβ25-35+ Matrine-H组。Con组正常培养细胞，不作任何处理；Aβ25-35组采用20 μmol/L的Aβ25-35处理细胞24 h；Aβ25-35+ Matrine-L组、Aβ25-35+Matrine-M组、Aβ25-35+Matrine-H组先分别给予苦参碱0.5、1.0、1.5 mmol/L处理2 h，再给予20 μmol/LAβ25-35处理细胞24 h。采用MTT法检测细胞增殖。
1.5 流式细胞术检测细胞凋亡和ROS含量 1.5.1 细胞凋亡收集各组细胞，调整密度为6×105/ mL，1 000 r/min离心10 min取细胞沉淀，加入500 μL Binding Buffer制备细胞悬液，按照凋亡试剂盒操作，依次加入5 μL Annexin V-FITC和PI，避光反应15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
1.5.2 ROS含量检测收集各组PC12细胞，倒出培养液，每孔加入1 mL DCFH-DA试剂，培养箱中静置20 min，待细胞与探针充分接触，用不含血清培养液冲洗3次，收集细胞，加入1 mL不含血清培养液，采用流式细胞仪进行检测。
1.6 酶联免疫吸附法检测SOD、GSH-Px、IL-6、IL-1β和TNF-α表达水平各组PC12细胞以3 000 r/min离心5 min后取上清液，按照相关试剂盒说明书，采用酶联免疫吸附法检测SOD、GSH-Px、IL-6、IL-1β和TNF-α的表达水平。
1.7 Western blotting检测AMPK/SIRT1通路相关蛋白表达取各组PC12细胞，加裂解液置于冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白与2×上样缓冲液混合，置于水浴锅高温煮沸5 min，经12%凝胶电泳处理50 μg蛋白样品，80 V、30 min，120 V、90 min，转膜、封闭培养2 h，加入AMPK、p-AMPK、SIRT1及β-actin在4℃孵育24 h，室温二抗稀释液孵育1 h，滴加化学发光试剂，暗室曝光、显影，Image J分析各蛋白条带灰度值。
1.8 统计学分析采用SPSS 21.0软件进行统计分析，数据以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同浓度苦参碱对PC12细胞生长的影响0 mmol/L组与0.25 mmol/L组24 h、48 hOD值比较差异无统计学意义(P > 0.05)；与0 mmol/L组相比，0.5 mmol/L组、1.0 mmol/L组、1.5 mmol/L组、2.0 mmol/L组24 h、48 h的OD值显著增加(P < 0.05)，但1.5 mmol/L组与2.0 mmol/L组比较，差异无统计学意义(P > 0.05)。故本研究以0.5、1.0、1.5 mmol/L苦参碱用于后续实验。见表 1。
| Group | 24 h | 48 h |
| 0 mmol/L | 0.66±0.05 | 0.83±0.06 |
| 0.25 mmol/L | 0.69±0.04 | 0.80±0.05 |
| 0.5 mmol/L | 0.85±0.061) | 1.12±0.071) |
| 1.0 mmol/L | 0.99±0.061) | 1.38±0.111) |
| 1.5 mmol/L | 1.25±0.121) | 1.62±0.151) |
| 2.0 mmol/L | 1.01±0.141) | 1.47±0.151) |
| F | 58.767 | 92.765 |
| P | < 0.001 | < 0.001 |
| 1) P < 0.05 vs. 0 mmol/L group at the same time point. | ||
2.2 不同浓度苦参碱对Aβ25-35诱导PC12细胞生长和凋亡的影响
与Con组相比，Aβ25-35组24 h、48 h的OD值、Bcl-2蛋白表达显著降低(P < 0.05)，凋亡率、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达显著增加(P < 0.05)；与Aβ25-35组相比，Aβ25-35+Matrine-L组、Aβ25-35+Matrine-M组、Aβ25-35+ Matrine-H组24 h、48 h的OD值、Bcl-2蛋白表达显著增加(P < 0.05)，凋亡率、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达显著降低(P < 0.05)。见图 1、表 2。
|
| A, apoptosis diagram; B, apoptosis-related protein. 1, Con group; 2, Aβ25-35 group; 3, Aβ25-35+Matrine-L group; 4. Aβ25-35+Matrine-M group; 5, Aβ25-35+ Matrine-H group. 图 1 苦参碱对Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡的影响 Fig.1 Effect of matrine on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25-35 |
| Group | OD | Apoptosis rate (%) | Bax | Bcl-2 | Cleaved caspase-3 | |
| 24 h | 48 h | |||||
| Con | 0.62±0.04 | 0.87±0.06 | 4.52±0.62 | 0.25±0.04 | 0.85±0.11 | 0.38±0.04 |
| Aβ25-35 | 0.16±0.021) | 0.32±0.041) | 21.96±2.421) | 0.78±0.061) | 0.35±0.061) | 1.12±0.141) |
| Aβ25-35+Matrine-L | 0.25±0.042) | 0.46±0.042) | 19.45±1.942) | 0.64±0.052) | 0.44±0.042) | 0.96±0.112) |
| Aβ25-35+Matrine-M | 0.40±0.062) | 0.57±0.052) | 15.63±1.592) | 0.52±0.042) | 0.59±0.052) | 0.75±0.092) |
| Aβ25-35+Matrine-H | 0.58±0.042) | 0.74±0.062) | 9.32±1.152) | 0.34±0.052) | 0.75±0.062) | 0.52±0.072) |
| F | 205.670 | 166.640 | 168.335 | 175.636 | 83.231 | 90.078 |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| 1) P < 0.05 vs. Con group；2) P < 0.05 vs. Aβ25-35 group. | ||||||
2.3 不同浓度苦参碱对Aβ25-35诱导PC12细胞氧化损伤的影响
与Con组相比，Aβ25-35组SOD、GSH-Px活性显著降低(P < 0.05)，ROS的含量显著增加(P < 0.05)；与Aβ25-35组相比，Aβ25-35+Matrine-L组、Aβ25-35+Matrine-M组、Aβ25-35+Matrine-H组SOD、GSH-Px活性显著增加(P < 0.05)，ROS含量显著降低(P < 0.05)。见表 3。
| Group | SOD (U/mg) | GSH-Px (U/mg) | ROS content (%) |
| Con | 56.88±5.41 | 68.57±6.39 | 100.35±2.69 |
| Aβ25-35 | 16.14±2.451) | 22.67±3.591) | 163.45±15.431) |
| Aβ25-35+Matrine-L | 23.15±3.122) | 31.42±4.572) | 149.42±11.452) |
| Aβ25-35+Matrine-M | 32.44±4.522) | 46.74±5.182) | 130.43±9.482) |
| Aβ25-35+Matrine-H | 47.62±4.362) | 62.54±6.982) | 113.15±8.752) |
| F | 151.924 | 115.351 | 54.918 |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| 1) P < 0.05 vs. Con group；2) P < 0.05 vs. Aβ25-35 group. | |||
2.4 不同浓度苦参碱对Aβ25-35诱导PC12细胞炎性因子的影响
与Con组相比，Aβ25-35组IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著增加(P < 0.05)；与Aβ25-35组相比，Aβ25-35+Matrine-L组、Aβ25-35+Matrine-M组、Aβ25-35+Matrine-H组IL-6、IL-1β、TNF-α表达显著降低(P < 0.05)。见表 4。
| Group | IL-6 | IL-1β | TNF-α |
| Con | 27.85±4.13 | 32.41±6.88 | 65.42±7.85 |
| Aβ25-35 | 146.87±16.971) | 185.64±20.621) | 243.68±35.691) |
| Aβ25-35+Matrine-L | 113.15±14.212) | 143.14±11.522) | 203.42±21.872) |
| Aβ25-35+Matrine-M | 87.64±10.302) | 92.62±10.582) | 152.69±15.482) |
| Aβ25-35+Matrine-H | 43.52±6.522) | 57.89±6.742) | 86.72±11.422) |
| F | 164.862 | 229.605 | 117.429 |
| P | < 0.001 | < 0.001 | < 0.001 |
| 1) P < 0.05 vs. Con group；2) P < 0.05 vs. Aβ25-35 group. | |||
2.5 不同浓度的苦参碱对Aβ25-35诱导PC12细胞中AMPK/SIRT1通路相关蛋白的影响
与Con组相比，Aβ25-35组p-AMPK、SIRT1蛋白表达显著增加(P < 0.05)；与Aβ25-35组相比，Aβ25-35+Matrine-L组、Aβ25-35+Matrine-M组、Aβ25-35+Matrine-H组p-AMPK、SIRT1蛋白表达显著降低(P < 0.05)。见图 2、表 5。
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| 1, control group; 2, Aβ25-35 group; 3, Aβ25-35+Matrine-L group; 4. Aβ25-35+ Matrine-M group; 5, Aβ25-35+Matrine-H group. 图 2 AMPK、p-AMPK和SIRT1蛋白表达 Fig.2 Expression of AMPK, p-AMPK, and SIRT1 proteins |
| Group | p-AMPK | AMPK | SIRT1 |
| Con | 0.18±0.05 | 0.80±0.10 | 0.27±0.06 |
| Aβ25-35 | 0.87±0.061) | 0.82±0.09 | 0.90±0.101) |
| Aβ25-35+Matrine-L | 0.74±0.072) | 0.84±0.11 | 0.78±0.062) |
| Aβ25-35+Matrine-M | 0.56±0.052) | 0.82±0.12 | 0.65±0.072) |
| Aβ25-35+Matrine-H | 0.35±0.042) | 0.81±0.08 | 0.43±0.062) |
| F | 234.685 | 0.194 | 114.916 |
| P | < 0.001 | 0.940 | < 0.001 |
| 1) P < 0.05 vs. Con group；2) P < 0.05 vs. Aβ25-35 group. | |||
3 讨论
研究[8-9]发现，Aβ25-35是保留全长Aβ毒性的最短片段，且Aβ25-35所致的细胞毒性是诱导神经元损伤和阿尔茨海默病主要根源。本研结果显示，Aβ25-35可刺激PC细胞异常凋亡和生长，并加速细胞氧化损伤和炎症反应。
近年来研究[10]发现，中药材、针灸等传统方法可有效治疗阿尔茨海默病。许多纯天然药物可有效改善学习和记忆功能，还可抑制Aβ寡聚体毒性以保护神经元[11]，药理研究[12]也证实，从中药材内分离出的一些活性单体，如丹参酮、人参皂苷等对阿尔茨海默病神经元具有保护作用。
苦参碱是从中药材中提出而来的一种生物碱，具有较高的水溶性、但脂溶性较差，研究学者通常在13-位修饰以提供脂溶性[13]。ZHU等[14]研究结果显示，苦参碱通过抑制ProNGF和NGF通路激活可有效改善神经胶质细胞死亡和轴突变性。李娟等[15]认为，苦参碱可减轻脂多糖诱导的阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力，并减轻脑组织神经炎性损伤。姚遥等[16]研究结果也显示，苦参碱可减轻阿尔茨海默病小鼠学习记忆功能，并减轻脑内氧化损伤。以上结论说明苦参碱对脑神经有保护作用，但也有研究[17]认为，苦参碱浓度超过2 mmol/L对神经细胞具有一定抑制作用，可能与诱导线粒体途径损伤有关。本研究通过MTT实验检测不同浓度苦参碱对PC12细胞生长的影响，发现浓度超过2 mmol/L对PC12细胞具有抑制作用，这与上述结果一致，本研究选择0.5、1.0、1.5 mmol/L苦参碱进行后续实验。结果显示，低、中、高剂量苦参碱可促进细胞增殖活性，并抑制细胞凋亡率，下调Bax、cleaved caspase-3蛋白表达，上调Bcl-2蛋白表达，并减少氧化应激、炎性细胞因子表达，提示苦参碱可抑制Aβ25-35诱导PC12细胞凋亡、氧化应激和炎症损伤。
AMPK/SIRT1通路是与细胞代谢、凋亡和氧化应激等有关信号通路，AMPK具有高度保守特性，可被体内多种激酶激活，进而发挥不同生物学效应[18]。SIRT1是哺乳动物NAD+依赖的组蛋白脱乙酰化酶，广泛表达于细胞核中，与细胞增殖、衰老和调节新陈代谢等过程关系密切[19]。研究[20]发现，SIRT1对脑神经具有保护作用，可参与阿尔茨海默病的病理进展。ZHAO等[21]研究发现，AMPK与SIRT1具有相互调节作用，AMPK与SIRT1可相互调节，形成正反馈，进而调节机体生理病理过程。虾青素可通过抑制AMPK-SIRT1通路激活减轻七氟醚所致的海马神经元细胞氧化损伤和凋亡[22]。本研究结果显示，Aβ25-35组p-AMPK、SIRT1蛋白表达上调，不同浓度苦参碱可下调p-AMPK、SIRT1蛋白表达，提示苦参碱对Aβ25-35诱导的PC12细胞有保护作用，可能与AMPK/SIRT1通路有关，但具体作用机制有待进一步研究。
综上所述，苦参碱可减轻Aβ25-35诱导PC12细胞氧化损伤和炎症反应，并抑制细胞凋亡，其作用机制可能与抑制AMPK/SIRT1通路的激活有关。
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