2024, Vol. 53文章信息
- 李雨珊, 王鹏皓
- LI Yushan, WANG Penghao
- 白藜芦醇介导SIRT2干预地塞米松诱导的骨髓间充质干细胞线粒体自噬
- Study of resveratrol-mediated SIRT2 intervention in dexamethasone-induced mitophagy in bone marrow mesenchymal stem cells
- 中国医科大学学报, 2024, 53(8): 731-735
- Journal of China Medical University, 2024, 53(8): 731-735
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文章历史
- 收稿日期：2023-08-11
- 网络出版时间：2024-07-23 09:52:31
引用本文 |
2. 中国医科大学附属第一医院骨科，沈阳 110001
2. Department of Orthopaedics, The First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China
骨质疏松症是一种典型的衰老相关疾病，而骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）功能障碍被认为骨丢失的主要原因。研究[1]认为，骨组织氧化应激增加是骨质疏松症的主要因素之一。自噬在缺氧或应激条件下被激活，是细胞内稳态的重要调节因子，而线粒体自噬是一种选择性自噬形式，能够选择性地消除衰老或受损的线粒体，有助于线粒体质量控制，并参与应激反应[2]。SIRT2是NAD+依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶的sirtuin家族之一，影响NAD酶解过程中蛋白质底物的去乙酰化。SIRT2在多种生物学功能调节中起着重要作用，包括线粒体稳态、细胞衰老和细胞死亡。SIRT2在小鼠中的激活与骨质疏松症等多种相关疾病的延迟发作相关[3]。白藜芦醇（resveratrol，Res）富含于红酒、葡萄和其他各种食物来源中，而SIRT2可被氧化应激和Res治疗激活[4]。Res通过激活SIRT2在BMSCs、成骨细胞和破骨细胞活性之间的平衡中发挥了重要作用，进而维持老年小鼠体内的骨密度[5]。Res可能通过激活BMSCs中的SIRT2来抑制二氧化氢诱导的细胞凋亡。本研究旨在阐明Res通过介导SIRT2调控地塞米松（dexamethasone，Dex）诱导的BMSCs线粒体自噬的作用机制，为骨质疏松症的治疗提供一种新的方向。
1 材料与方法 1.1 实验材料细胞培养基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Gibco公司，Res购自美国Sigma公司，SIRT2抑制剂NAM购自美国Sigma公司，多克隆兔抗小鼠TOM20抗体（sc-11415）（1∶200）、单克隆小鼠抗小鼠LC-3抗体（sc-376404）（1∶1 000）和多克隆山羊抗小鼠Hsp60抗体（sc-10520）均购自美国圣克鲁斯生物技术公司，TRIzol试剂购自中国生命技术有限公司，TaqMan试剂购自日本TaKaRa公司。
1.2 小鼠BMSCs的培养及分组小鼠BMSCs购自中国北京常青藤转化医学中心。细胞在含有10 %胎牛血清MEM中传代培养，在37 ℃下含5% CO2细胞于不同浓度的Res（0 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L和10-6 mol/L）中培养24 h。SIRT2抑制剂NAM也用于暴露或非暴露在10-6 mol/L Dex后的BMSCs。细胞共分为5组：正常对照组，常规培养；Dex组，培养液中加入Dex（10-6 mol/L）；Res组，培养液中加入Res（10-6、10-7、10-8 mol/L）；Dex+Res组，培养液中加入Dex（10-6 mol/L）及Res（10-6、10-7、10-8 mol/L）；NAM组，培养液中加入NAM（100 μmol/L）及Res（10-6、10-7、10-8 mol/L）。
1.3 蛋白质制备和Western blotting检测采用PBS洗涤BMSCs细胞，应用放射免疫沉淀试验缓冲液收集所有蛋白，在4 ℃下12 000 r/min离心10 min，收集上清液，与缓冲液混合，100 ℃ 10 min变性，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对样品进行分离。然后将样品转移到聚偏氟乙烯膜上。将细胞膜与含有Tween 20（TBST）和5%牛血清白蛋白的tris缓冲盐水（tris buffer saline，TBS）孵育120 min，TBS洗涤3次，将细胞膜与相关的一抗在4 ℃下孵育过夜，用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1.5 h。用TBST洗涤膜3次，使用BeyoECl+试剂盒（Beyotime，中国）显色。
1.4 实时PCR检测从BMSCs细胞中提取总RNA，逆转录为cDNA，实时PCR检测SIRT2 mRNA表达。使用引物Premer5.0软件（美国）设计所有引物。见表 1。引物由南京金思瑞科技有限公司合成。
| Gene | Primer design |
| SIRT2 | Forward primer 5’-GTTGTGTGCCTTCGTTTTGGA-3’ |
| Reverse primer 5’-AGGCCGGTTTGGCTTATACA-3’ | |
| LC-3 | Forward primer 5’-CTCTCTGAGCCTTAGGTGCC-3’ |
| Reverse primer 5’-ACTCGTGGGGTGACCATTTC-3’ | |
| Beclin-1 | Forward primer 5’-GAATGGAGGGGTCTAAGGCG-3’ |
| Reverse primer 5’-CCTCTTCCTCCTGGCTCTCT-3’ | |
| GAPDH | Forward primer 5’-AGTCTACTGGCGTCTTCACC-3’ |
| Reverse primer 5’-CCACGATGCCAAAGTTGTCA-3’ |
实时PCR反应条件如下：94 ℃ 4 min，95 ℃变性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延长30 s，循环35次，72 ℃延长6 min。扩增后，加入5 µL PCR产物和1 µL DNA上载缓冲液，在60 V下进行电泳。
1.5 透射电子显微镜观察BMSCs细胞在2.5 %戊二醛PBS中室温固定2 h，然后在1 %四氧化饿和2 %醋酸铀酰水中固定1 h。经梯度乙醇脱水后包埋切片。将样品用醋酸铀酰和柠檬酸铅双染色，使用JEM-1200EX透射电子显微镜（JEM-1200EX，日本电子株式会社）观察样品。
1.6 细胞增殖检测BMSCs细胞接种在96孔板中培养24 h，分别用10-6 mol/L Dex、10-6 mol/L Res和10-6 mol/L NAM处理。在培养基中加入10 mmol/L BrdU溶液培养2.5 h。BMSCs细胞在4 %多聚甲醛中固定后，使用细胞增殖ELISA BrdU比色试剂盒（罗氏公司，美国）测量BrdU掺入量。
1.7 细胞活力检测BMSCs细胞接种在96孔板中培养24 h，分别用10-6 mol/L Dex、10-6 mol/L Res和10-6 mol/L NAM处理BMSCs细胞，加入10 µL MTT试剂（5 mg/mL），37 ℃孵育4 h，加入100 µL二甲亚砜溶解。采用光谱Max Plus 384酶标仪（德国）在570 nm波长下测量光密度。
1.8 统计学分析采用SPSS 15.0软件进行统计分析。所有数据以 x±s表示。方差齐性检验采用Leven检验。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和LSD检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Res增强BMSCs细胞增殖和SIRT2活性表达将Res（10-8到10-6 mol/L）作用于BMSCs（作用时间0~120 min），检测SIRT2 mRNA和蛋白的表达。应用Res（10-8到10-6 mol/L）作用BMSCs 120 min（图 1A），应用Res（10-6 mol/L）作用BMSCs（0~120 min）后行Western blotting检测（图 1B）。结果显示，Res以剂量依赖性和时间依赖的方式增强了BMSCs中SIRT2的表达。同时，将Res（10-6 mol/L）作用于暴露在Dex（10-6 mol/L）中的BMSCs细胞。BrudU和MTT检测结果显示，Dex（10-6 mol/L）显著下调了BMSCs细胞内SIRT2 mRNA和蛋白的表达（图 1C），并且抑制了BMSCs细胞的增殖和活力（图 1D），Res（10-6 mol/L）显著抑制了Dex对BMSCs细胞增殖及SIRT2表达的负性调控作用。然而，NAM可以消除Res对BMSCs中SIRT2表达的影响（图 1C）。
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| A, real-time PCR was used to detect SIRT2 mRNA expression; B, Western blotting was performed to assess the time-dependent expression of SIRT2 expression; C, Western blotting was performed to assess the concentration-dependent expression of SIRT2 expression; D, detection of cell proliferation and viability. 1, control group; 2, Dex group; 3, Res group; 4, Dex+Res group; 5, Res+NAM group.*P < 0.05 vs. control group. 图 1 Res对BMSCs内SIRT2表达和细胞增殖的影响 Fig.1 Effect of Res on SIRT2 expression and cell proliferation in BMSCs |
2.2 Res抑制Dex诱导的BMSCs线粒体自噬
应用透射电镜观测Res和Dex对BMSCs细胞内线粒体自噬的影响。结果显示，Dex增加了BMSCs细胞内线粒体自噬小体的数量，而Res增强了此效应（图 2）。采用实时PCR和Western blotting检测细胞内线粒体自噬关键因子的表达，结果显示，Res（10-6 mol/L）显著增加了LC-3 mRNA和Beclin-1 mRNA的表达水平（P < 0.05，图 3A、3B），降低了TOM20和Hsp60蛋白的表达水平（P < 0.05，图 3C、3D）。
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| A, control group(×1 000); B, Dex group(×1 000); C, Dex+Res group(×1 000); D, the number of mitochondrial autophagosomes in BMSCs cells. *P < 0.05 vs. control group. Arrows indicate autophagosomes under election microscopy. 图 2 Res对BMSCs内自噬小体的影响 Fig.2 Effect of Res on autophagosomes within BMSCs |
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| A, real-time PCR was used to detect LC3 mRNA expression; B, real-time PCR was used to detect Beclin-1 mRNA expression; C, Western blotting was performed to detect TOM20 expression; D, Western blotting was performed to detect HSP60 expression. 1, control group; 2, Dex group; 3, Res group; 4, Dex+Res group; 5, Res+NAM group. *P < 0.05 vs. control group. 图 3 Res对BMSCs内线粒体自噬关键分子的影响 Fig.3 Effect of Res on key molecules of mitochondrial autophagy in BMSCs |
3 讨论
线粒体在人类衰老的发展中发挥重要作用，线粒体功能障碍可引起一系列的代谢变化，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生增加，ATP和氧的消耗减少，甚至导致细胞死亡。线粒体自噬通过消除线粒体防止ROS的积累。不仅可以通过清除受损的线粒体来保护细胞，还可以促进新线粒体的生物合成，这对细胞内稳态至关重要。在人类衰老过程中，自噬可以缓解氧化应激的增加，细胞自噬是年龄相关性骨质疏松症的一个重要因素。自噬的减少似乎促进了氧化应激的增加，从而导致骨丢失，而自噬的增加则抑制了这种作用[6]。此外，年龄相关的骨量丢失与骨ROS水平的增加和骨质疏松患者外周血SIRT2活性有关[7]。SIRT2是细胞防御氧化应激和细胞存活的重要调节因子之一，可以被Res激活来维持线粒体功能[8]。本研究结果显示，Res以剂量依赖和时间依赖的方式增强了BMSCs中SIRT2的表达。此外，Res增强了Dex处理的BMSCs的SIRT2表达，而NAM消除了Res对SIRT2表达的影响。
线粒体靶向自噬在预防衰老、神经退行性疾病等病理过程中发挥重要作用[9]。本研究结果显示，Dex+Res组的线粒体自噬标志蛋白TOM20和Hsp60均低于Dex组。同样，最近的1项研究[10]报道显示，Hela细胞的血清饥饿可以诱导线粒体自噬，使LC-3增加、TOM20降低。自噬通常是一个自限性的过程，通过多种机制保护细胞免于细胞死亡，包括维持生物能量稳态、错误折叠和聚集倾向蛋白的循环、以及去除未偶联或可渗透性线粒体。细胞凋亡的内在途径由线粒体膜通透性（mitochondrial membrane permeability，MMP）启动[11]。如果MMP仅限于线粒体的一部分，将导致极化线粒体的选择性自噬去除，并防止细胞死亡。当SIRT2被抑制时，Res就失去了增加线粒体自噬的能力[12]。Res通过上调p53的去乙酰化来增加SIRT2的表达和激活，从而下调Akt的磷酸化[13]。本研究结果证实，Res可以通过增强SIRT2的表达诱导线粒体自噬，从而削减Dex对BMSCs的负性调节作用。然而，Res治疗骨质疏松症需要进一步的实验研究，以确认自噬功能障碍和骨质疏松症之间的可能关系，为预防和治疗骨质疏松症提供依据。
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