肺癌在全球常见癌症中居第3位，癌症死亡原因中居第1位^[1]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是原发性肺癌的主要类型，约占85%，其发病率和死亡率均较高^[2-4]。尽管NSCLC外科手术和治疗干预方面已经取得了很大的进步，但是患者预后仍然很差；并且由于治疗抵抗或肿瘤转移，受试者的复发率很高^[5]。目前，NSCLC治疗方法主要包括手术、放疗、化疗、免疫治疗和分子靶向治疗^[6]。放疗是手术无法切除的晚期NSCLC患者的主要治疗手段，约77%NSCLC患者有放疗的循证指征^[7]。然而，长期大剂量放疗会导致患者产生抗辐射，最终导致癌症复发^[8]。因此，开发有效的方案来克服NSCLC治疗中的放射抗性是重要的挑战。为了减轻抗辐射并提高NSCLC患者的存活率，明确产生抗辐射的分子机制已是刻不容缓。

基于GSE197236数据集分析了NSCLC抗辐射A549（radiation-resistant A549，A549-RR）细胞和A549细胞的差异表达基因，发现角蛋白6A（keratin 6A，KRT6A）在A549-RR细胞中表达上调。KRT6A基因位于染色体12q13.13，其编码的KRT6A是Ⅱ型角蛋白家族成员，可导致鳞状上皮表皮化^[9]。已有研究^[10]表明，肺腺癌中KRT6A高表达与患者较差的预后相关。KRT6A通过诱导上皮-间质转化（epithelial- mesenchymal transition，EMT）促进肺腺癌的生长和转移^[11]。然而，KRT6A在NSCLC抗辐射中发挥的作用及详细机制目前尚无报道。本研究建立A549-RR细胞，并验证KRT6A在A549-RR细胞中表达情况；进一步探究KRT6A表达对A549-RR细胞抗辐射的影响及其作用机制，旨在为KRT6A作为改善NSCLC抗辐射的潜在靶点提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 细胞来源、培养和转染

NSCLC A549细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。用含10%胎牛血清和1%青链霉素的Ham’s F-12K培养基在37 ℃含5%CO2的恒温培养箱中长期培养细胞。转染根据实验方案严格按照慢病毒试剂盒说明书进行。

1.2 A549-RR细胞建立及分组

取对数生长期的A549细胞，首次用4 Gy照射，传代培养待细胞贴壁生长后，再次用4 Gy照射，继续上述传代培养及照射至总剂量达60 Gy。进一步培养获得A549-RR细胞并验证。分别按照慢病毒转染试剂盒说明书转染敲减对照（sh-NC）组、敲减KRT6A（sh-KRT6A）组、敲减KRT6A和过表达对照（sh-KRT6A+ ov-NC）组以及敲减KRT6A和过表达β-catenin（sh- KRT6A+ov-β catenin）组慢病毒。

1.3 主要试剂和仪器

胎牛血清、青链霉素和Ham’s F-12K培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司，Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物科技公司，CCK-8检测试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、流式细胞仪和酶标仪购自美国Thermo公司，KRT6A、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug和β- catenin抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司，倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司，全自动化学发光分析系统购自上海天能科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 CCK-8法检测细胞增殖活力

将各组细胞以5×10³/孔分别接种于96孔板中，每组细胞分别接种4块96孔板，分别于0 h（培养过夜后即），24、48、72 h取出一块96孔板，弃培养基，加入CCK-8检测液，37 ℃孵育1 h，酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.4.2 平板克隆形成实验检测细胞克隆形成能力

将各组细胞以1×10³/孔均匀铺于6孔板中。继续培养14 d后弃培养基，PBS洗去残余培养基。加入4%多聚甲醛室温固定15 min，PBS洗涤3次。加入0.1%结晶紫染色液，室温染色1 h。洗去多余染色液，晾干并拍照。

1.4.3 流式细胞术检测细胞凋亡

各组分别取5×10⁴个细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入195 μL Annexin V-FITC结合液轻轻重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC，轻轻混匀，加入10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温避光孵育20 min后流式细胞仪检测。

1.4.4 Western blotting检测

收集细胞，使用RIPA裂解液提取组织或细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，蛋白样品充分变性后上样于聚丙烯酰胺凝胶中，SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜，二抗室温孵育1 h，PBST洗膜，ECL化学发光，使用ImageJ软件进行灰度分析。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量资料采用x±s 表示，2组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，并采用Tukey事后检验进行组间两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 A549-RR细胞验证及KRT6A在A549-RR细胞中表达情况

CCK-8法检测结果（图 1A）显示，与A549细胞比较，A549-RR细胞增殖活性显著升高（P < 0.05）；平板克隆形成实验检测结果（图 1B）显示，与A549细胞比较，A549-RR细胞克隆形成能力显著升高（P < 0.05）；流式细胞术检测结果（图 1C）显示，与A549细胞比较，A549-RR细胞凋亡率显著降低（P < 0.05）；说明成功建立了A54-RR细胞。

Western blotting检测结果（图 1D）显示，与A549细胞比较，A549-RR细胞KRT6A蛋白表达显著升高（P < 0.05）。

2.2 KRT6A表达对A549-RR细胞抗辐射能力的影响

Western blotting检测结果（图 2A）显示，与sh-NC组比较，sh-KRT6A组A549-RR细胞KRT6A蛋白表达显著降低（P < 0.05）。CCK-8法检测结果（图 2B）显示，与sh-NC组比较，sh-KRT6A组A549-RR细胞增殖活性显著降低（P < 0.05）。平板克隆形成实验检测结果（图 2C）显示，与sh-NC组比较，sh-KRT6A组A549-RR细胞克隆形成能力显著降低（P < 0.05）。流式细胞术检测结果（图 2D）显示，与sh-NC组比较，sh-KRT6A组A549-RR细胞凋亡率显著升高（P < 0.05）。

2.3 敲减KRT6A对A549-RR细胞EMT相关蛋白表达的影响

Western blotting检测结果（图 3）显示，与sh-NC组比较，sh-KRT6A组A549-RR细胞E-cadherin蛋白表达显著升高，N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白表达显著降低（均P < 0.05）。

2.4 敲减KRT6A对A549-RR细胞Wnt/β-catenin信号通路的影响

Western blotting检测结果（图 4）显示，与sh-NC组（0.92±0.03）比较，sh-KRT6A组（0.45±0.03）A549-RR细胞β-catenin蛋白表达显著降低（P < 0.05）。

2.5 KRT6A通过Wnt/β-catenin信号通路影响A549-RR细胞EMT

Western blotting检测结果（图 5）显示，与sh-NC组比较，sh-KRT6A组和sh-KRT6A+ov-NC组A549-RR细胞E-cadherin蛋白表达显著升高，β-catenin、N- cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白表达显著降低（均P < 0.05）。

与sh-KRT6A组和sh-KRT6A+ov-NC组比较，sh-KRT6A+ov-β catenin组A549-RR细胞E-cadherin蛋白表达显著降低，β-catenin、N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白表达显著升高（均P < 0.05），可见过表达β-catenin逆转敲减KRT6A对A549-RR细胞EMT的抑制作用。

2.6 KRT6A通过Wnt/β-catenin信号通路影响A549-RR细胞抗辐射能力

CCK-8法检测结果（图 6A）显示，与sh-NC组比较，sh-KRT6A组和sh-KRT6A+ov-NC组A549-RR细胞增殖活性显著降低（均P < 0.05）；与sh-KRT6A组和sh-KRT6A+ov-NC组比较，sh-KRT6A+ov-β-catenin组A549-RR细胞增殖活性显著升高（均P < 0.05）。平板克隆形成实验检测结果（图 6B）显示，与sh-NC组比较，sh-KRT6A组和sh-KRT6A+ov-NC组A549-RR细胞克隆形成能力显著降低（均P < 0.05）；与sh-KRT6A组和sh-KRT6A+ov-NC组比较，sh-KRT6A+ov-β-catenin组A549-RR细胞克隆形成能力显著升高（均P < 0.05）。流式细胞术检测结果（图 6C）显示，与sh-NC组比较，sh-KRT6A组和sh-KRT6A+ov-NC组A549-RR细胞凋亡率显著升高（P < 0.05）；与sh-KRT6A组和sh-KRT6A+ov-NC组比较，sh-KRT6A+ov-β-catenin组A549-RR细胞凋亡率显著降低（均P < 0.05）。

3 讨论

多项研究表明，KRT6A参与多种癌症进展。CHEN等^[12]发现KRT6A在膀胱癌组织中表达上调，且促进膀胱癌细胞存活、增殖和黏附，减少细胞凋亡。CHEN等^[9]发现KRT6A在鼻咽癌细胞中表达上调，其沉默可抑制鼻咽癌细胞活力、转移和侵袭以及Wnt/β-catenin通路激活。CHE等 ^[13]发现KRT6A在NSCLC组织中高表达，其高表达与患者不良预后相关，其过表达促进NSCLC细胞增殖和侵袭，而且通过MYC信号通路上调葡萄糖-6-磷酸脱氢酶水平并增加磷酸戊糖途径的流量。YANG等^[11]发现KRT6A在肺腺癌组织中高表达，其高表达与淋巴结阳性和侵袭性肿瘤T分期呈正相关；敲除KRT6A可抑制肺腺癌细胞增殖、迁移和集落形成能力并促进肿瘤干细胞转化和EMT。本研究成功建立了A549-RR细胞；发现A549-RR细胞增殖活力和克隆形成能力较A549细胞明显升高，细胞凋亡率明显降低，表明A549-RR细胞建立成功。此外，本研究结果显示，A549-RR细胞KRT6A蛋白表达较A549细胞明显上调，且敲减KRT6A降低了A549-RR细胞增殖活力和克隆形成能力，增加了细胞凋亡率，提示敲减KRT6A增加了A549-RR细胞放疗敏感性。

研究显示，EMT过程分为Ⅰ型（EMT参与着床、胚胎发生和胚胎发育器官发育^[14]）、Ⅱ型（EMT促进组织再生和器官纤维化^[15]）、Ⅲ型（EMT转移能力逐渐增强以及获得对包括放射治疗在内的抗癌治疗的抗性^[16]）3种类型。越来越多的证据^[17]表明，EMT是参与抗辐射的重要过程，而且可诱导肿瘤细胞抗辐射。已有研究^[11]表明，KRT6A促进肺腺癌细胞EMT进程。因此，本研究推测KRT6A介导的A549-RR细胞抗辐射可能与EMT激活有关。本研究检测了敲减KRT6A对A549-RR细胞EMT相关蛋白表达的影响，发现敲减KRT6A增加了A549-RR细胞上皮细胞标志物E-cadherin蛋白表达并降低间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin、Snail和Slug蛋白表达，提示敲减KRT6A抑制了A549-RR细胞EMT。

Wnt信号通路对于正常胚胎发育和细胞分化必不可少^[18]。β-catenin是Wnt信号通路的转录激活因子，其去磷酸化激活后可导致其在细胞核中的积累^[19]。多项研究^[20-21]表明，Wnt/β-catenin信号通路激活促进了NSCLC的EMT过程。CHEN等^[9]证明了KRT6A对鼻咽癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活作用。本研究发现敲减KRT6A降低了A549-RR细胞β-catenin蛋白表达，表明敲减KRT6A抑制了A549-RR细胞Wnt/β-catenin信号通路激活。此外，本研究还发现过表达β-catenin逆转了敲减KRT6A对A549-RR细胞EMT的抑制作用。同样，过表达β-catenin还逆转了敲减KRT6A对A549-RR细胞抗辐射的抑制作用。

综上所述，KRT6A在NSCLC A549-RR细胞中表达上调，敲减KRT6A降低了A549-RR细胞抗辐射能力，其机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路诱导的EMT有关。因此，KRT6A可能是改善NSCLC抗辐射的潜在靶点。