2024, Vol. 53文章信息
- 王莉, 王兴胜, 赵秀萍, 王爱娣, 屈红梅, 马燕花
- WANG Li, WANG Xingsheng, ZHAO Xiuping, WANG Aidi, QU Hongmei, MA Yanhua
- YAP调控Notch信号通路影响小鼠NASH肝纤维化的机制及慈菇消脂方的干预作用
- Mechanism of Notch signaling pathway regulated by YAP in NASH liver fibrosis mice and the intervention effect of Cigu Xiaozhi prescription
- 中国医科大学学报, 2024, 53(5): 392-400
- Journal of China Medical University, 2024, 53(5): 392-400
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文章历史
- 收稿日期：2023-06-13
- 网络出版时间：2024-05-14 14:55:05
引用本文 |
2. 甘肃中医药大学第三附属医院·白银市第一人民医院消化二部，甘肃 白银 730900
2. The Second Department of Gastroenterology, The Third Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine · The First People's Hospital of Baiyin, Baiyin 730900, China
非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohe-patitis，NASH）是一类除酒精因素引起的以肝细胞损伤、肝脂肪变性、炎症细胞浸润乃至纤维化为特征的疾病，可发展为肝纤维化、肝硬化、肝细胞癌和肝衰竭[1-2]。肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）产生的富含Ⅰ型胶原的细胞外基质沉积是造成NASH肝纤维化或肝硬化的主要原因[3]。在肝脏发育过程中，Notch信号通常处于休眠状态，但在肥胖和NASH时作为一种促进纤维化发展的适应不良修复信号被异常激活[4]。研究[5]发现，Yes相关蛋白（Yes-associated protein，YAP）在肝纤维化HSC及肌成纤维细胞中存在显著的核累积。在人肝细胞癌中，配体Jagged1被确定为YAP下游的直接靶点，有助于肿瘤中Notch信号的高活性[6]。YAP/TEAD可直接控制肝脏再生中Notch2受体的表达调节信号转导。因此，YAP与Notch信号通路在NASH肝纤维化中的作用尤为重要。慈菇消脂方是以山慈菇为君药的中药复方，中药慈菇消脂丸具有治疗脂肪肝、抗炎、抗纤维化等功效[7-8]。因此，本研究拟探讨YAP因子对NASH肝纤维化Notch信号通路的影响，以及中药慈菇消脂方在防治NASH肝纤维化中的作用，旨在为治疗NASH肝纤维化提供理论基础和依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物健康雄性SPF级C57BL/6J小鼠，7周龄，体重（20±2）g，购自北京斯贝福生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2019-0010。小鼠饲养于甘肃中医药大学实验动物中心SPF级屏障环境中。本研究获得甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准[SYXK（甘）2021-198]。
1.1.2 中药慈菇消脂方药物购自甘肃中医药大学附属医院药房，经杨锡仓主任药师鉴定。中药慈菇消脂方由山慈菇10 g，柴胡12 g，丹参20 g，土鳖虫20 g，薏苡仁30 g，黄芩10 g，泽泻15 g，枸杞20 g，生山楂20 g，法半夏15 g等14味中药组成。前期急性毒理学研究结果显示，慈菇消脂方对小鼠灌胃给药的最大可给药量为18.4 g/kg，为临床成人用量的122.7倍，说明本品毒性较低。
1.1.3 试剂anti-YAP抗体（ab205270）、anti-Notch1抗体（ab52627）购自美国Abcam公司；anti-Notch2抗体（D76A6）购自美国Cell Signaling Technology公司；anti-Jagged1抗体（T55726）购自中国Abmart公司；anti-DLL4抗体（21584-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司；纤维胶原蛋白Ⅰ（collagenⅠ，ColⅠ）抗体（bs-5078R）购自北京博奥森生物技术有限公司；anti-β-actin抗体（YM3028）、α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗体（YM3365）购自美国Immunoway公司。维替泊芬（verteporfin，VP）（A8327）购自美国APExBIO公司；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自江苏酶免实业有限公司。MolPure® Cell/Tissue Total RNA Kit（19221ES50）购自上海翊圣生物科技有限公司。PCR引物由北京博迈德基因技术有限公司合成。
1.1.4 实验仪器化学发光成像仪（MiniChemi 610）购自北京赛智科技有限公司。酶标仪（iMark）购自美国Bio-Rad公司。
1.2 方法 1.2.1 NASH肝纤维化小鼠模型构建NASH肝纤维化小鼠模型造模方法参照文献[9]，给予蛋氨酸-胆碱缺乏（methionine and choline deficient，MCD）饮食12周+小剂量CCl4腹腔注射6周，诱导NASH肝纤维化模型。根据肝腺泡3区纤维化、肝小叶内纤维化、门静脉周围纤维化、中央静脉周围纤维化、桥接纤维化的程度及肝硬化，可将NASH分为4期[10]，分别为S1期（局灶性或广泛性肝腺泡3区、窦周纤维化），S2期（S1期病变+局灶性或广泛性门静脉周围纤维化），S3期（S2期病变+局限性或广泛性桥接纤维化），S4期（弥漫性肝纤维化+肝假小叶，包括肝硬化合并NASH、隐匿性肝硬化及脂肪性肝硬化）。
1.2.2 慈菇消脂方给药剂量参照药理实验方法学、中药药理学研究方法[11]及课题组前期经验，按照人-小鼠体表面积换算系数（9.1）计算小鼠等效剂量，成人用药量的9.1倍作为中药高剂量组，成人用药量的4.55倍作为中药低剂量组，灌胃体积均为0.2 mL/10 g。
1.2.3 动物分组及给药SPF级C57BL/6J小鼠60只，按随机数字表法分为正常组、NASH肝纤维化模型组、VP干预组、VP+中药高剂量组、VP+中药低剂量组及DMSO对照组6组，每组8只。（1）正常组：标准饲料+生理盐水10 mL/kg灌服，1次/d。（2）模型组：MCD饮食12周+CCl4腹腔注射6周（10 μL/10 g），2次/周。（3）VP组：造模第7周初尾静脉注射VP（5 mg·kg-1·d-1）6周，1次/3 d。（4）（5）VP+中药高、低剂量组：造模第7周初尾静脉注射VP同时给予中药慈菇消脂方高剂量（32.76 g·kg-1·d-1）、低剂量（16.38 g·kg-1·d-1）干预治疗6周，1次/3 d。（6）DMSO对照组：造模第7周初尾静脉注射2%DMSO溶液（体积同VP组）持续6周，1次/3 d。
于12周末，小鼠禁食24 h，次日10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速取出肝脏。取部分肝脏置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋；其余肝脏经冷生理盐水清洗后铝箔包裹置于液氮内速冻，-80 ℃冰箱冻存。
1.2.4 小鼠肝脏指数计算各组小鼠末次给药后禁食24 h，脱颈处死，取出肝脏组织并称重，计算肝脏指数（%）=肝脏平均重量/体重×100。
1.2.5 肝脏组织学分析4%中性甲醛固定小鼠肝脏，石蜡包埋，制5 μm厚切片，HE、Masson染色，显微镜下观察肝组织病理形态，并用Olympus BX43+sc50型显微成像系统分析图片，观察肝组织纤维化程度，计算肝组织纤维化水平（%）=Masson蓝染色面积/总面积×100。
1.2.6 ELISA称取小鼠肝脏组织1 g，加入PBS并充分匀浆，离心后收集上清。根据ELISA试剂盒说明书检测肝纤维化四项指标（PC Ⅲ、Col Ⅳ、LN、HA）。所有检测均重复进行，读数与使用试剂盒提供的标准蛋白构建的标准曲线进行比较。
1.2.7 肝脏羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量检测称量80 mg组织并水解，调节水解产物pH6.0~6.8。加入蒸馏水至最终体积为10 mL/管，并充分混合。取约3~4 mL溶液，加入20~30 mg活性炭并充分混合，3 500 r/min离心10 min。按照试剂盒说明书制备测试溶液、空白管和标准管。测定550 nm波长处的吸光度，并计算肝脏中Hyp的含量。
1.2.8 免疫组织化学法分析α-SMA、ColⅠ、Notch1和YAP在NASH肝纤维化中的定位石蜡载玻片二甲苯脱蜡，分级乙醇水化，75℃焙烧2 h后在去离子水中再水化。室温下用3% H2O2孵育10 min。37℃下用山羊血清孵育30 min。用柠檬酸钠溶液（pH 8.0）热法提取抗原。加入抗α-SMA、抗ColⅠ、抗YAP及抗Notch1抗体（稀释1︰200），4 ℃孵育过夜。加入酶标抗兔IgG作为二抗。DAB染色，苏木精染色。
1.2.9 Western blotting检测Western blotting检测：取约100 mg肝组织，RIPA裂解并匀浆，离心后收集上清。BAC法测定蛋白浓度。蛋白上样后10% SDS-PAGE电泳分离、转膜，5%脱脂奶粉封闭2 h。加入Notch2、Jagged1、DLL4以及β-actin一抗（稀释1︰1 000），4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次，加入相应二抗孵育2 h。ECL化学发光，凝胶成像系统成像，并使用Image J 1.53 e软件进行分析。
1.2.10 实时定量PCR检测肝组织匀浆后，经TRIzol试剂提取、纯化总RNA及cDNA逆转录后，采用实时定量PCR检测α-SMA、ColⅠ、YAP、Notch1/2、Jagged1及DLL4 mRNA的相对表达量。PCR反应体系：cDNA模板1 μL、Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）5 μL、正向/反向引物各0.2 μL、ddH2O 3.6 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。记录各组样品Ct值，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达量，并以空白对照组作为参照，计算各组目标基因mRNA的相对表达量。引物序列及产物长度见表 1。
| Gene | Primer sequence（5’-3’） | Length of product（bp） |
| GAPDH | 183 | |
| F | GGTTGTCTCCTGCGACTTCA | |
| R | TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC | |
| YAP | 292 | |
| F | CCATAAGAACAAGACCACATCC | |
| R | TCCATCCTGCTCCAGTGTAG | |
| Notch1 | 299 | |
| F | GATGATGTCGCTGGATAC | |
| R | TCACTCTCACAGTTGCG | |
| Notch2 | 295 | |
| F | TGATGAGTGTATCTCCAAGCC | |
| R | GGTGTAACTGTTGACATAGTCGG | |
| Jagged1 | 200 | |
| F | TGTGGGACTCATCAGCC | |
| R | CAGCCTCCAGAACACTCAC | |
| DLL4 | 225 | |
| F | ACCAACTCCTTCGTCGTCAG | |
| R | TTGCTCGTTGTTCGCC | |
| ColⅠ | ||
| F | CTCGTGGATTGCCTGGAAC | |
| R | ACAGCACCATCGTTACCGC | |
| α-SMA | 210 | |
| F | TGGTGTGCGACAATGGC | |
| R | TGGTGATGATGCCGTGTTC |
1.3 统计学分析
采用Graphpad prism 6.0和SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以x±s表示，2组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。采用GraphPad Prism 9.0软件进行绘图。
2 结果 2.1 各组小鼠肝脏指数比较与正常组小鼠肝脏指数（0.042 1±0.002 7）比较，模型组（0.056 2±0.008 7）明显升高（P < 0.01）；与模型组比较，VP组（0.049 3±0.001 7，P < 0.05）、VP+中药高剂量组（0.044 4±0.000 5，P < 0.01）、VP+中药低剂量组（0.048 4±0.002 8，P < 0.01）肝脏指数显著降低。
2.2 各组小鼠肝脂肪变性、炎症及纤维化情况比较造模第4、6、10、12周时，动态观察肝组织纤维化病变，HE、Masson染色结果（图 1）显示，随造模时间延长，肝细胞脂肪变性逐渐加重、出现多量脂肪小滴，并伴有炎症细胞（淋巴细胞和中性粒细胞）浸润及纤维组织增生；造模后期局部出现肝细胞坏死、溶解，甚至肝硬化等表现（S4期）。
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| A, steatosis and fat droplets; B, hepatocyte necrosis, lysis, and inflammatory cell infiltration; C, fibrosis, liver cirrhosis. 图 1 NASH肝纤维化小鼠肝组织HE染色×100 Fig.1 HE staining of liver tissue from mice with NASH liver fibrosis×100 |
2.2.1 肝组织HE染色（图 2）
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| VP, verteporfin; CGXZ, Cigu Xiaozhi precription. 图 2 各组小鼠肝脏组织HE染色×200 Fig.2 HE staining of liver tissue in each group×200 |
正常组肝组织结构完整，肝索排列整齐，肝细胞及肝巨噬细胞形态正常。模型组小鼠肝细胞肿胀明显、胞质透明，肝小叶、门管区及窦周纤维结缔组织弥漫性增生，伴炎症细胞浸润、脂肪变性。与模型组比较，VP组、VP+中药低、高剂量组肝纤维化及脂肪变性均明显改善，基本无脂滴存在。其中，VP联合中药复方的治疗效果较为显著，脂肪变性明显减少。因采用2%DMSO溶解VP粉末，故DMSO组作为VP组的对照组，肝纤维化与脂肪变性仍存在，但无大片的肝细胞坏死、肝硬化等严重的病理发生，因此认为2%DMSO溶液对肝脏的毒性较小，不影响实验结果。
2.2.2 肝组织Masson染色（图 3）
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| 图 3 各组小鼠肝脏组织Masson染色×200 Fig.3 Masson staining of liver tissue in each group ×200 |
造模第10、12周，模型组肝组织肝小叶、门静脉区以及窦周均存在明显的纤维化。计算第12周模型组小鼠的胶原纤维面积比约为40%，显著高于正常组（P < 0.05），表明模型组小鼠肝脏发生了明显的纤维化病变。Masson染色显示，与正常组比较，模型组小鼠肝脂肪变性且存在弥漫性胶原纤维；与模型组相比，VP+中药高剂量组基本无纤维增生，VP组及VP+中药低剂量组肝细胞间质仍存在少量纤维结缔组织增生。DMSO对照组相较于VP组有广泛性胶原纤维。
综上所述，本研究于第12周末成功建立了小鼠NASH肝纤维化模型。其中，1~6周单纯MCD饮食导致小鼠肝细胞大量脂肪变性、胞质内充满了脂肪小滴；7~12周加用小剂量CCl4后，肝细胞逐渐出现弥漫性胶原纤维增生。VP及VP+中药慈菇消脂方联合用药均明显改善了NASH肝纤维化小鼠的肝组织病理损伤，且VP与慈菇消脂方的联合用药对NASH肝纤维化的治疗效果更为显著。
2.3 各组小鼠肝纤维化指标比较（表 2）| Group | PC Ⅲ | Col Ⅳ | LN | HA |
| Control | 4.399 1±0.257 1 | 53.530 4±2.302 8 | 401.322 8±9.179 6 | 61.008 7±2.472 7 |
| Model | 7.967 3±0.197 11） | 88.073 8±1.726 71） | 579.365 1±17.872 31） | 94.792 5±1.967 21） |
| VP | 5.314 8±0.590 02） | 64.683 8±3.612 72） | 412.169 3±20.083 82） | 68.634 2±5.466 42） |
| VP+ low-dose CGXZ | 5.671 7±0.106 62） | 72.324 4±3.953 12） | 520.899 5±30.329 62） | 88.180 5±4.281 02） |
| VP+ high-dose CGXZ | 5.463 2±0.202 82） | 70.538 6±3.676 92） | 472.486 8±21.1262） | 68.827 2±4.178 22） |
| 1）P < 0. 01 vs. control group；2）P < 0. 01 vs. model group. | ||||
与正常组比较，模型组小鼠肝纤维化四项指标PC Ⅲ、Col Ⅳ、LN和HA水平均显著升高（P < 0.01）。与模型组比较，VP组及VP+中药慈菇消脂方组小鼠肝脏中PC Ⅲ、Col Ⅳ、LN和HA水平均显著降低（P < 0.01）。
2.4 各组小鼠肝脏Hyp含量比较碱性水解法测定小鼠肝脏中Hyp含量，结果显示，与正常组（0.105 8±0.003 0）相比，模型组肝脏Hyp含量（0.286 5±0.001 6）明显升高（P < 0.01）。与模型组相比，VP组（0.150 7±0.020 1）及VP+中药低剂量、高剂量组（0.078 2±0.001 2，0.186 7±0.002 1）Hyp含量明显降低（P < 0.01）。
2.5 各组小鼠肝组织中α-SMA、ColⅠ、Notch1蛋白表达情况比较 2.5.1 α-SMA、ColⅠ（图 4~5）
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| 图 4 各组小鼠肝脏组织中α-SMA免疫组织化学染色×200 Fig.4 α-SMA immunohistochemical staining in liver tissue of mice in each group×200 |
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| 图 5 各组小鼠肝脏组织中ColⅠ免疫组织化学染色×200 Fig.5 Immunohistochemical staining of ColⅠ in liver tissue of mice in each group×200 |
免疫组织化学染色结果显示，α-SMA、ColⅠ蛋白表达主要定位于肝细胞质中。与正常组比较，模型组肝组织中α-SMA、ColⅠ表达增加；与模型组比较，VP组及VP+中药高、低剂量组表达明显减少，且VP+中药高剂量组尤为显著。
2.5.2 YAP、Notch1（图 6~7）
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| 图 6 各组小鼠肝脏组织中Notch1免疫组织化学染色×200 Fig.6 Notch1 immunohistochemical staining in liver tissue of mice in each group×200 |
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| 图 7 各组小鼠肝脏组织中YAP免疫组织化学染色×200 Fig.7 YAP immunohistochemical staining in liver tissues of mice in each group ×200 |
与正常组比较，模型组小鼠肝脏中YAP、Notch1蛋白明显沉积、着色加深，细胞核中YAP沉积尤为明显。与模型比较，VP组以及VP+中药高、低剂量组肝脏中YAP、Notch1的着色显著减少，其中以VP+中药高剂量组减少更为显著。
2.6 YAP及慈菇消脂方干预NASH肝纤维化后Notch信号通路蛋白的表达Western blotting结果（表 3、图 8）显示，与正常组比较，模型组肝组织中Notch2、Jagged1蛋白呈高表达（P < 0.05），DLL4蛋白表达无显著差异。与模型组比较，VP组（P < 0.05）及VP+中药高、低剂量组（P < 0.01）Notch2蛋白均呈低表达；VP+中药高、低剂量组（P < 0.05）Jagged1蛋白低表达，VP组无显著差异；VP+中药高剂量组DLL4蛋白呈高表达（P < 0.05）。
| Group | Notch2 | Jagged1 | DLL4 |
| Control | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
| Model | 1.37±0.151） | 2.37±0.651） | 0.62±0.24 |
| VP | 0.93±0.192） | 1.88±0.69 | 0.92±0.51 |
| VP+ low-dose CGXZ | 0.57±0.293） | 1.32±0.522） | 0.97±0.29 |
| VP+ high-dose CGXZ | 0.47±0.173） | 1.36±0.652） | 1.19±0.202） |
| DMSO | 0.65±0.28 | 1.42±0.57 | 0.70±0.20 |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. model group；3）P < 0.01 vs. model group. | |||
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| K, control; M, NASH liver fibrosis model group; VP, VP intervention; VP+D, VP+low-dose CGXZ; VP+G, VP+high-dose CGXZ; DMSO, DMSO control. 图 8 Western blotting结果 Fig.8 Results of Western blotting |
2.7 各组小鼠肝组织中Notch通路相关因子mRNA的表达情况（表 4）
| Group | ColⅠ | α-SMA | YAP | Notch1 | Notch2 | Jagged1 | DLL4 |
| Control | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 | 1.000±0.000 |
| Model | 2.600±0.2461） | 1.285±0.1781） | 2.282±0.1961） | 1.485±0.0101） | 3.958±0.1391） | 3.051±0.1251） | 0.936±0.140 |
| VP | 1.682±0.1222） | 0.593±0.0982） | 1.853±0.1523） | 1.243±0.0323） | 2.839±0.4222） | 1.323±0.2172） | 0.990±0.404 |
| VP+low-dose CGXZ | 0.799±0.0142） | 0.118±0.0092） | 0.803±0.0092） | 0.582±0.0602） | 0.539±0.1552） | 0.881±0.1942） | 2.399±0.252 |
| VP+high-dose CGXZ | 0.725±0.0982） | 0.470±0.0292） | 1.178±0.0192） | 0.223±0.0392） | 0.451±0.0652） | 0.838±0.0432） | 6.753±0.9052） |
| DMSO | 2.700±0.444 | 0.829±0.104 | 1.978±0.643 | 1.199±0.066 | 3.856±0.534 | 1.700±0.278 | 1.268±0.249 |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.01，3）P < 0.05 vs. model group. | |||||||
实时定量PCR检测结果显示，与正常组比较，模型组中α-SMA、ColⅠ、YAP以及Notch1/2、Jagged1 mRNA均呈高表达（P < 0.01），DLL4 mRNA无明显变化（P > 0.05）。与模型组比较，VP组及VP+中药高、低剂量组中α-SMA、ColⅠ、YAP、Notch1/2及Jagged1 mRNA均下调（均P < 0.05）。此外，与模型组比较，DLL4 mRNA仅在VP+中药高剂量组呈高表达（P < 0.01），其他干预组中无明显差异（P > 0.05）。上述结果均与Western blotting及免疫组织化学检测结果基本一致。
3 讨论NASH肝纤维化的发生、发展是一个多信号通路调控的复杂过程，Hedgehog、TGF-β/Smad、Notch、Hippo-YAP/TAZ、Wnt/β-catenin等通路以及一系列细胞因子之间形成复杂的交互网络，共同影响肝纤维化的发生与发展[12-13]。因此，目前认为联合具有不同但互补作用机制的疗法是提高疗效、减缓疾病进展甚至逆转NASH的最佳途径。
研究[14]表明，HSC的转分化（或激活）是纤维化的主要驱动因素。α-SMA作为HSC活化标志物，ColⅠ的沉积及肝纤维化四项均可反映肝脏纤维化病变程度。本研究分别采用ELISA法检测肝纤维化四项，碱水法检测肝组织中Hyp含量，免疫组织化学染色观察α-SMA、ColⅠ在肝组织中的表达定位。结果显示，NASH肝纤维化模型小鼠肝脏中Hyp含量、肝纤维化四项指标均明显升高，胞质中α-SMA与ColⅠ染色显著增加，表明α-SMA高表达及ColⅠ显著沉积使HSC大量激活与增殖，模型小鼠肝脏发生了显著的肝纤维化病变。为进一步研究YAP在NASH肝纤维化中的相关机制，通过尾静脉注射药物VP特异性阻断YAP的表达，结果发现，抑制YAP表达后，肝脏中α-SMA、ColⅠ表达明显下调，肝纤维化四项及Hyp含量显著减少，肝纤维化程度减轻；因此，推测Hippo通路的下游调控因子YAP可能通过上调α-SMA及ColⅠ表达激活HSC，促进NASH肝纤维化发生、发展。
本研究还发现，模型组小鼠肝脏中YAP、Notch1明显沉积，YAP在细胞核中沉积尤为明显，抑制YAP表达后，Notch1蛋白受体呈现同样的下调趋势。为进一步探索YAP对Notch信号通路的影响及慈菇消脂方对NASH肝纤维化的干预作用，本研究采用Wes-tern blotting、实时定量PCR检测了Notch通路中相关蛋白及mRNA的表达，同时设置了不同浓度的中药干预组，结果显示，VP药物有效抑制YAP因子表达后，α-SMA、ColⅠ蛋白表达下调，Notch信号通路蛋白Notch1/2、Jagged1表达下调，DLL4表达上调，抑制Notch信号通路活化干预NASH肝纤维化的发生、发展。
基于中医理论基础，认为痰湿、浊脂（毒）在NASH肝纤维化的发病机制中起关键作用，而慈菇消脂方的整体处方以解痰降浊脂为主。中药慈菇消脂方属于复方制剂，具有多成分、多靶点作用，NASH肝纤维化小鼠经中药慈菇消脂方干预6周后，肝组织中α-SMA、ColⅠ沉积显著减少，肝纤维化四项指标及Hyp含量明显降低，HE与Masson染色显示肝纤维化程度减轻，证明了慈菇消脂方在治疗NASH肝纤维化方面的确切疗效。同时，Western blotting与实时定量PCR检测结果也同样证明了中药方慈菇消脂方的多靶点作用。因此，推测中药慈菇消脂方可能通过减少α-SMA及ColⅠ的沉积抑制HSC活化，从而发挥抗纤维化作用；同时，下调YAP及Notch信号通路相关蛋白的表达，从而干预NASH肝纤维化。此外，本研究还发现VP联合中药慈菇消脂方后治疗效果更佳。
综上所述，抑制YAP可调控Notch信号通路相关蛋白，下调Notch1/2、Jagged1，上调DLL4，抑制Notch信号通路活化，干预NASH肝纤维化发生。以解毒、化痰法组方的中药慈菇消脂方通过多成分、多靶点下调YAP、Notch1/2、Jagged1，上调DLL4表达，抑制Notch信号通路活化，改善NASH肝纤维化进展。
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