克罗恩病（Crohn’s disease，CD）是一种炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD），主要表现为胃肠道不同部位的慢性炎症。近年来CD发病率呈上升趋势^[1]。目前，CD的病因尚不明确。已有研究^[2]表明，遗传、环境、炎症、感染与肠道菌群等因素增加了CD发生和进展的风险。CD不仅表现有肠道损伤，还可导致肠外全身性症状，严重影响患者的生活质量和预后^[3]。研究^[1]显示，特异性生物标志物可以帮助临床医生在CD的诊断和干预中获益，并在明确治疗反应和预测CD复发方面发挥作用。因此，明确CD发生的分子机制和关键生物标志物对CD的治疗具有重要意义。目前已发现100多个与CD相关的基因。MCGOVERN等^[4]研究发现对肠道细菌的炎症反应是CD发病的关键因素，并指出NOD2、IL23R、ATG16L1是CD的强相关基因。而且NOD2/CARD15基因与回肠受累、肠道纤维化狭窄有关^[5]。

本研究利用生物信息学方法对CD炎症相关关键基因及信号通路进行分析，筛选并验证CD炎症相关的关键基因，旨在为CD诊断治疗提供有利支持。

1 材料与方法 1.1 数据来源

在基因表达综合（gene expression omnibus，GEO）数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中以“Crohn’s disease”为关键词检索CD表达谱高通量测序/芯片数据。纳入标准：（1）数据集为肠组织样本测序数据；（2）同时含有健康人对照和CD患者信息；（3）数据集含有CD活动指数信息。排除标准：（1）儿童CD；（2）血液样本数据；（3）药物临床试验表达谱数据。获得GSE193677、GSE66407和GSE179285 3个数据集。GSE193677数据集（461例健康人和1 157例CD患者肠组织样本）为分析数据集，GSE66407数据集（99例健康人和103例CD患者肠组织样本）和GSE179285数据集（31例健康人和168例CD患者肠组织样本）为验证数据集。炎症反应相关基因（inflammator response related genes，IRGs）下载自分子特征数据库（molecular signatures database，Msigdb；https://www.gsea-msigdb.org），共200个基因用于后续分析。

1.2 炎症浸润分析

利用Python3.80软件pydeseq2包对GSE193677数据集做标准化转换，然后使用GSEApy包的单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）获得CD患者和健康人16种炎症细胞和13种炎症分子通路的富集情况并比较，结果利用plotly包进行分析。

1.3 炎症相关差异表达基因（inflammation-related differentially expressed genes，IRDEGs）筛选

利用Python3.80软件pydeseq2包对GSE193677数据集进行差异表达基因（differential expression genes，DEGs）分析，筛选标准：|log₂FC|≥1且FDR校正P < 0.05。DEGs与IRGs取交集，获得IRDEGs。利用seaborn包分析IRDEGs在GSE66407数据集中的表达情况。

1.4 IRDEGs的富集分析

利用Python3.80软件GSEApy包对IRDEGs进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.5 IRDEGs的蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建和关键IRDEGs筛选

利用STRING数据库（http://string-db.org/）对IRDEGs进行PPI分析。PPI网络数据导入至Cytoscape 3.80软件构建网络图，利用Cytoscape软件的cytoHubba插件筛选鉴定关键基因，并对最大团中心性（maximum clique centrality，MCC）、邻域组件中心性（neighborhood component centrality，MNC）、最大邻域组件中心性（maximum neighborhood component centrality，DNMC）、紧密中心性、度中心性和边缘渗透组件（edge percolated component，EPC）6种拟合方法分别获得得分排名前10位的关键基因，取交集获得关键IRDEGs。

1.6 关键IRDEGs与CD活动指数的相关分析

GSE193677数据集中包含健康人对照和CD患者的CD活动指数信息。分析GSE193677数据集中关键IRDEGs在5种活动指数（健康，非活动，轻度、中度、重度活动）CD患者中的表达情况。

1.7 关键IRDEGs的验证

在GSE66407和GSE179285数据集中，比较关键IRDEGs在健康对照组和CD组、炎症组和非炎症组中的表达情况。

1.8 统计学分析

2组比较由scipy包的Welch’s t检验完成，P值经statsmodels包FDR方法校正；多组比较方差齐性检验使用scipy包levene函数。其中，方差齐性的多组比较由statsmodels包的单因素方差分析完成，两两比较P值经statsmodels包TuKey方法校正；方差不齐多组比较由scipy包的Kruskal-Wallis检验完成，两两比较由scipy包的Mann-Whitney U检验完成并经bonferroni方法校正P值。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CD患者炎症浸润情况

结果显示，辅助性T细胞、中性粒细胞、调节性T细胞、树突状细胞（dentritic cells，DC）、巨噬细胞、NK细胞等在CD患者中表达均显著上调（图 1A）；13种炎症分子通路均在CD患者中显著上调（图 1B）。

2.2 GSE193677数据集中IRDEGs筛选及表达结果

结果显示，共筛选出450个DEGs，其中378个上调基因，72个下调基因。同时从Msigdb数据库中获取200个IRGs。DEGs与IRGs取交集，获得24个IRDEGs。24个IRDEGs表达情况见图 2。

2.3 IRDEGs富集分析

GO分析结果显示，IRDEGs在未成熟T细胞扩增调节、细胞黏附调节、CXCR趋化因子受体结合、丝氨酸蛋白抑制剂复合物等方面明显富集（图 3）。KEGG通路分析显示，IRDEGs在IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞因子及其受体相互作用、IBD等信号通路显著富集（图 4）。

2.4 PPI网络构建和关键IRDEGs筛选

利用STRING数据库构建IRDEGs的PPI网络，见图 5。利用Cytoscape软件cytoHubba插件中的6种拟合方法（MCC、MNC、DNMC、紧密中心性、度中心性和EPC）筛选得分（由高到低排序）前10位基因，见表 1。取交集获得7个关键IRDEGs，包括IL1A、SELE、CXCL11、CSF3、CXCL9、CXCL10和CCL7。

2.5 关键IRDEGs与CD活动指数的相关分析

结果显示，7种关键IRDEGs在不同的临床病情活动状态下表达存在差异，并随着病情加重而呈现表达上升的趋势（图 6）。

2.6 关键IRDEGs的验证

结果显示，GSE66407数据集中，与健康对照组比较，CD组中IL1A、SELE、CXCL11、CXCL9、CXCL10和CCL7表达明显升高（均P < 0.001）；与非炎症组比较，炎症组中IL1A、SELE、CXCL11、CXCL9、CXCL10和CCL7表达也明显升高（均P < 0.01）。GSE179285数据集中，与健康对照组比较，CD组SELE、CSF3、CXCL11、CXCL9、CXCL10和CCL7表达均明显升高（均P < 0.01）；与非炎症组比较，炎症组7种IRDEGs表达均明显升高（均P < 0.05）。见图 7。

3 讨论

生物信息学研究手段有助于拓宽复杂多基因疾病的研究方向，有助于挖掘导致CD的新基因，为CD的发病机制提供新的见解。本研究通过一系列生物信息学分析方法，获得了CD中7个关键IRDEGs，包括IL1A、SELE、CXCL11、CSF3、CXCL9、CXCL10和CCL7；同时对7个关键IRDEGs进行了验证。GO功能富集分析中显示24个IRDEGs主要在未成熟T细胞扩增调节、细胞黏附调节、CXCR趋化因子受体结合、丝氨酸蛋白抑制剂复合物等方面明显富集；KEGG通路分析显示，IRDEGs在IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞因子及其受体相互作用、IBD等信号通路显著富集。

多项研究^[1]报道了IBD中持续的T细胞炎症激活。CD是促炎细胞因子（IL-12、IL-18、IL-23）导致过度的T辅助细胞（T-helper cell，TH）1和TH17细胞反应引起的。TH1和TH17细胞分泌促炎性细胞因子IL-17、IFN-γ和TNF，这些促炎性细胞因子通过刺激巨噬细胞、内皮细胞和单核细胞产生TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和IL-18而使炎症持续存在^[6]。此外，研究^[7]显示CD患者上皮内淋巴细胞中IL-17A、IFN-γ和TNF增加。因此，IRDEGs的KEGG通路富集分析结果表明，这些IRDEGs可能通过IL-17信号通路、TNF信号通路、细胞因子及其受体相互作用等途径参与了CD的进展。

IL1A是一种多效细胞因子，参与各种炎症反应、炎症过程和造血。产生IL-23的单核巨噬细胞在IBD发病机制中起着核心作用，近期研究^[8]发现，IL-1α/IL-1β是调节产生IL-23的单核细胞的关键细胞因子。本研究结果显示，IL1A表达水平随着CD严重程度加重而升高。因此，IL1A可能在CD发病机制中起着关键作用。SELE基因编码的蛋白存在于细胞因子刺激的内皮细胞中，被认为是导致白细胞在炎症部位聚集的原因^[9-10]。目前，关于SELE对CD发生发展的影响尚不明确。

CXCL11、CXCL10、CXCL9均属于趋化因子超家族成员，该家族编码分泌蛋白，参与免疫调节和炎症反应。CXCL11、CXCL10、CXCL9均能与CXCR3结合^[11]。其中，CXCL9与T细胞运输有关，CXCL9与CXCR3结合能趋化淋巴细胞。CXCL10蛋白与CXCR3结合可产生多效性作用，包括刺激单核细胞、自然杀伤细胞和T细胞迁移，以及调节黏附分子表达。近期研究^[12]发现，CD未来风险比值最高的蛋白是CXCL9，CXCL9是唯一与其他CD风险生物标志物显著相关且作用方向一致的蛋白。此外，CXCR3配体（CXCL11和CXCL9）与回肠结肠切除术后CD复发密切相关^[13]。以往也有研究^[14]指出，IBD患者黏膜上皮细胞中TLR3能介导CXCL10释放，并在活动期IBD患者中观察到CXCL10基因在结肠黏膜中表达升高。因此，可以认为CXCL11、CXCL10、CXCL9与CD发生发展关系密切。

CSF3蛋白能控制粒细胞的产生、分化和功能。研究^[15]发现与缓解期的结肠活检结果相比，活动期的结肠活检结果显示CSF3转录水平明显增加。另一项研究^[16]显示，CSF3可以作为抗TNF治疗失败的CD患者潜在的治疗靶点。本研究结果显示CSF3是CD的关键IRDEGs，同时明确了CSF3表达水平随着CD疾病严重程度增高而升高。CCL7基因编码单核细胞趋化蛋白3，是一种在炎症和转移过程中吸引巨噬细胞的分泌趋化因子。目前，关于CCL7对CD疾病发生发展的影响尚不明确。

综上所述，本研究通过生物信息学方法，筛选并验证了与CD密切相关的关键IRDEGs（IL1A、SELE、CXCL11、CSF3、CXCL9、CXCL10和CCL7）。为CD的治疗和诊断研究提供了理论支持。本研究属于生物信息学研究，未对获得的关键基因进行实验验证，今后将收集CD患者和健康人的组织和血液样本，进一步对7个关键IRDEGs进行论证。