胃癌的发病率和死亡率分别居全球第5位和第3位^[1]。尽管术后化疗、靶向治疗和免疫治疗已在一定程度上改善了胃癌患者的预后，但因其高死亡率和复发率，预后仍不尽如人意^[2]。目前，尚无可靠的生物标志物或技术能够准确评估胃癌患者的生存期^[3]。因此，迫切需要寻找新的胃癌治疗靶点，为临床诊治提供新的研究方向。

Warburg效应^[4]是癌症代谢的既定特征，是指肿瘤细胞优先通过糖酵解途径使用葡萄糖，而不是使用线粒体中的氧化磷酸化所产生的能量。癌细胞对糖酵解的依赖在一定程度上归因于线粒体功能的失调^[5]。琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）又称线粒体复合物Ⅱ，参与柠檬酸循环和电子传递，能直接连接线粒体电子传递链与三羧酸循环。SDH由SDHA、SDHB、SDHC和SDHD 4个亚基组成，亚基包含辅助因子FAD和琥珀酸的结合位点^[6]。研究^[7]表明，SDH复合物的正确组装对其功能至关重要。SDH亚基的基因突变所致组装缺陷可导致多种病变，包括副神经节瘤^[8]、胃肠道间质瘤^[9]。然而，SDHA在胃癌中的作用及其对胃癌预后的影响未见研究，因此，本研究拟通过体外实验探讨SDHA在胃癌细胞中的表达及其对胃癌细胞增殖和迁移侵袭的影响，旨在为胃癌的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞及培养

胃上皮细胞系GES-1及胃癌细胞系AGS、N87、MKN45、HGC-27购自中国科学院上海细胞库。细胞系用含10%胎牛血清（美国Gibco公司）的RPMI 1640培养基（北京索莱宝有限公司）在37 ℃、5%CO₂恒温培养箱（美国Thermo公司）中培养。

1.1.2 组织样本收集

收集2020年8月至2021年12月江苏省苏北人民医院胃肠外科手术切除的胃癌及相应癌旁正常组织共80对，所有癌组织标本均经病理学确诊为胃腺癌，术前未行放化疗，未合并其他肿瘤。由武汉塞维尔生物科技有限公司完成样本的组织芯片微阵列制作，提供每个芯片位点所对应的患者顺序并制成组织芯片。本研究获得江苏省苏北人民医院医学伦理委员会审核批准（2019KY-022）。所有患者均已签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色

将石蜡切片置于60 ℃烤箱中，冷却后用二甲苯及乙醇脱蜡；ddH₂O冲洗后将切片放入柠檬酸钠缓冲液抗原修复；用磷酸盐缓冲液漂洗；依次滴加内源性过氧化物酶阻断剂、山羊血清工作液、SDHA一抗（稀释1∶70），4 ℃过夜。次日加入生物素标记的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物，辣根酶标记链霉卵白素工作液；DAB显色；载玻片浸入苏木精；流水冲洗；梯度乙醇脱水，封片。采用NDP view2软件观察并扫描对比。由2名病理科医师独立阅片，并根据染色强度和染色面积进行定量分析。染色强度评分：0分（无色），1分（黄色），2分（棕色），3分（深棕色）。阳性细胞的百分比评分：≤5%为0分，> 5%~25%为1分，> 25%~50%为2分，> 50%~75%为3分，> 75%为4分。

1.2.2 Western blotting检测

取胃癌细胞系AGS、N87、MKN45、HGC-27和正常胃上皮细胞系GES-1，冰上裂解15 min，经4 ℃13 000 r/min离心15 min，取蛋白上清保存。用BCA蛋白浓度检测试剂盒确定浓度，剩余部分按比例加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃煮沸5 min，冷却后以15 μL/孔上样，经8%SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭1.5 h，加入一抗并4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，10 min/次；二抗孵育1 h，TBST洗涤3次，10 min/次。化学发光显影，分析目的蛋白和GAPDH的吸光度值作为蛋白的表达量。

1.2.3 SDHA敲低siRNA及过表达质粒转染

将胃癌细胞系N87、MKN45按2×10⁵/孔接种至6孔板，其中3孔设为实验组，另外3孔设为阴性对照组。培养24 h后将SDHA敲低siRNA（苏州吉玛基因股份有限公司）及Lipofectamine 2000混悬液加入实验组，6 h换液，转染48 h后进行细胞功能实验。将胃癌细胞系AGS、HGC-27按2×10⁵/孔接种至6孔板，其中3孔设为实验组，另外3孔设为阴性对照组。培养24 h后将SDHA过表达质粒（苏州吉玛基因股份有限公司）及Lipo2000混悬液加入实验组，6 h后换液，转染48 h后进行细胞功能实验。

1.2.4 细胞迁移和侵袭能力实验

Transwell实验，向小室上室中加入200 μL（1.5×10⁴个细胞）无血清悬液，下室中加入500 μL含10%胎牛血清培养基。水平置于恒温培养箱中培养48 h，4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色5 min，用湿棉签清除小室内部未穿出的细胞，晾干后在显微镜下观察细胞侵袭数量并拍照。细胞迁移实验，向小室上室中加入由无血清细胞培养基以1∶9比例稀释的基质胶，均匀铺在小室上室中，在37℃培养箱中放置2 h。后续实验步骤同Transwell实验。

1.2.5 划痕实验

在6孔板背面循直尺均匀间距划直线，在接种了转染细胞的6孔板中使用200 μL移液枪头循直线垂直划痕。6孔板放入37 ℃、5%CO₂恒温培养箱，于0、24 h用显微镜观察并拍照。

1.2.6 CCK-8实验

转染后细胞按1×10³/孔接种于96孔板，于24、48、72 h加入CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，测定450 nm波长吸光度（optical density，OD）值，并绘制细胞增殖曲线。

1.2.7 克隆形成实验

6孔板中加入转染后的细胞混悬液（2 mL/孔，500细胞/mL），置入37 ℃、5%CO₂培养箱连续培养14 d，弃培养基，用PBS洗3次，加入4-多聚甲醛（1 mL/孔）固定15 min，结晶紫染色5 min，晾干后拍照。

1.2.8 免疫细胞浸润相关性分析

通过TIMER 2.0数据库^[10]，利用CIBERSORT、XCELL、TIDE、EPIC多种算法对SDHA与免疫细胞浸润相关性进行分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。计量资料用x±s表示，2组间差异比较采用t检验；计数资料用率表示，采用χ²检验进行比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 SDHA在胃癌细胞系及胃癌组织中的表达

IHC结果显示，胃癌组织中SDHA表达高于相应正常组织（图 1A、1B）。Western blotting结果显示，与正常胃上皮细胞系GES-1比较，胃癌细胞系AGS、N87、MKN45、HGC-27中SDHA均呈高表达（图 1C、1D），差异均有统计学意义（P < 0.05）。

2.2 构建敲低及过表达SDHA胃癌细胞系

Western blotting结果显示，SDHA敲低组N87、MKN45细胞中SDHA表达明显减少（图 2A、2B），SDHA过表达组AGS、HGC-27细胞中SDHA表达明显增多（图 2C、2D），差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.3 SDHA异常表达对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响

Transwell及细胞迁移、侵袭实验结果发现，SDHA敲低组N87、MKN45细胞较阴性对照组穿过细胞明显减少（图 3A、3B），差异有统计学意义（P < 0.05），提示细胞迁移、侵袭能力明显降低；SDHA过表达组AGS、HGC-27细胞较阴性对照组穿过细胞明显增加（图 3C、3D），差异有统计学意义（P < 0.05），提示细胞迁移、侵袭能力明显增强。

2.4 SDHA异常表达对胃癌细胞迁移能力的影响

划痕实验结果显示，SDHA敲低组N87、MKN45细胞划痕愈合能力明显低于阴性对照组（图 3E、3F），差异有统计学意义（P < 0.05），表明敲低SDHA抑制了胃癌细胞的迁移能力。SDHA过表达组AGS、HGC-27细胞划痕愈合能力显著高于阴性对照组（图 3G、3H），差异有统计学意义（P < 0.05），表明过表达SDHA可增强胃癌细胞的迁移能力。

2.5 SDHA异常表达对胃癌细胞增殖能力的影响

CCK-8实验结果显示，SDHA敲低组胃癌细胞增殖能力减弱（图 4A、4B）（P < 0.05），SDHA过表达组胃癌细胞增殖能力增强（图 4C、4D），差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.6 SDHA异常表达对胃癌细胞克隆形成能力的影响

平板克隆形成实验结果显示，SDHA敲低组N87、MKN45细胞较阴性对照组克隆形成数明显减少（图 4E、4F），差异有统计学意义（P < 0.05）；SDHA过表达组AGS、HGC-27细胞较阴性对照组克隆形成数明显增加（图 4G、4H），差异有统计学意义（P < 0.05）。证明SDHA可影响胃癌细胞克隆形成能力。

2.7 SDHA表达与胃癌肿瘤微环境中免疫细胞浸润的关系

通过TIMER 2.0数据库利用CIBERSORT等不同免疫浸润算法，观察SDHA表达水平与胃癌肿瘤微环境中免疫细胞的关系，结果显示，SDHA与胃癌肿瘤免疫微环境中CD4⁺T细胞、中性粒细胞、滤泡辅助性T细胞、髓源性抑制细胞的浸润水平均呈正相关（P < 0.05），其中与滤泡辅助性T细胞（r = 0.17）关系最密切。见图 5A~5D。

3 讨论

传统化疗对胃癌的疗效有限，晚期胃癌患者生存率目前仍较低^[11]。近年来，分子靶向治疗的兴起及其对进展期胃癌的疗效使其成为极有价值的治疗手段。因此，不断寻求新的分子治疗靶点并探讨其治疗机制是目前研究的热点与难点。

由SDHA、SDHB、SDHC和SDHD 4个亚基组成的SDH在人体进化过程中高度保守，可折叠并组装成线粒体。这些亚基中任何一个的突变均会导致整个酶复合物的不稳定并降低SDH活性，从而使致癌代谢物琥珀酸盐在肿瘤细胞质和细胞外液中异常积累^[12]。琥珀酸盐在细胞转录组上的蓄积作用介导的假低氧表型诱导了代谢表型的改变，导致细胞代谢方式从线粒体呼吸到胞质糖酵解的生物能转换。另外，琥珀酸盐的积累促进上皮向间质的转化及迁移和侵袭，并促进血管的生成。除在癌症组织或血清样品中水平升高外，在食道癌、结直肠癌等不同肿瘤类型的癌症患者的尿液中也检测到琥珀酸盐。表明通过代谢组学分析可发现潜在的生物标志物。

SDH缺乏在某些罕见疾病和恶性肿瘤中已有研究^[13]。SDH的突变可能促进某些疾病的病理代谢^[14-15]。如SDH缺陷的胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是一类独特的GIST。SDH突变导致细胞能量代谢缺陷，触发琥珀酸盐沉积，是SDH缺陷型GIST的关键致癌机制。其中，约半数野生型GIST患儿SDH的4个亚基中有突变，其中SDHA突变最常见^[16]。在转移性葡萄膜黑色素瘤中，SDHA升高致代谢失调，伴随线粒体呼吸增加，导致耐药、肿瘤转移和患者死亡时间显著缩短^[17]。

SDHA在胃癌中的作用机制目前尚未明确。本研究结果证明了SDHA异常表达在胃癌中的潜在重要性。通过IHC检测发现，胃癌组织中SDHA表达水平高于癌旁组织。Western blotting结果显示，SDHA在胃癌细胞系中的表达高于正常胃上皮细胞。本研究还通过构建敲低、过表达SDHA胃癌细胞系，证明了SDHA异常表达可影响胃癌发展。CCK-8实验、平板克隆形成实验证实，SDHA可促进胃癌细胞的增殖，敲低SDHA可抑制胃癌细胞的增殖。通过划痕实验、Transwell实验证实了过表达SDHA可促进胃癌细胞的迁移和侵袭，敲低SDHA则能抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。本研究还通过TIMER 2.0数据库利用CIBERSORT等不同免疫浸润算法发现，SDHA与胃癌肿瘤免疫微环境中CD4⁺T细胞等多种免疫细胞密切相关。

综上所述，本研究结果表明，SDHA不仅有望成为胃癌诊治的潜在标志物，还可能成为胃癌新的治疗靶点。