胃癌是最常见的恶性肿瘤之一。研究^[1]表明，胃癌的发生和演进是多阶段、多基因和多因素共同参与的结果。参与基因主要包括癌基因、抑癌基因和DNA错配修复基因等^[2]。BTG4是TOB/BTG蛋白家族成员之一，具有抗增殖的特性，可诱导细胞G₁期阻滞和细胞凋亡^[3]。RÄTY等^[4]明确BTG4是一种富含半胱氨酸的分泌酸性蛋白，用于卵丘细胞扩张；可作为评估卵母细胞发育能力的潜在因子。LIU等^[5]报道了BTG4的纯合突变会导致合子卵裂失败和女性不孕。为了阐明BTG4在胃癌中的表达及临床意义，本研究对胃癌BTG4进行了生物信息学分析，同时采用实时PCR、Western blotting等方法检测胃癌组织中BTG4表达来进行验证。

1 材料与方法 1.1 生物信息学分析

1.1.1 Oncomine 4.5数据库（https://www.oncomine.org）

使用R软件（4.2.1版本）下载Oncomine数据库中DErrico数据，比较正常和胃癌组织中BTG4 mRNA表达水平，所有数据都进行对数转换，计算每组数据的平均值，并对所有数据进行归一化处理。

1.1.2 癌症基因组图谱计划（The Cancer Genome Atlas Program，TCGA）数据库（https://cancergenome.nih.gov/）

通过R软件中的TCGA-assembler从数据库中获取胃癌患者（n = 392）BTG4的表达数据（RNA-seqV2）和临床病理资料。分析BTG4 mRNA表达与胃癌患者临床指标和预后的关系。

1.1.3 仙桃数据库（https://www.xiantaozi.com/）

使用R软件（4.2.1版本）下载胃癌中BTG4的相关数据。统计方法采用Wilcoxon秩和检验；下载的数据则使用ggplot2 3.3.6软件包进行图像可视化。

1.1.4 Kaplan-Meier平台（http://kmplot.com）

使用Kaplan-Meier平台分析BTG4 mRNA表达（ID：220766_at）与胃癌患者预后的关系。筛选条件：（1）启动KM绘图仪用于胃癌；（2）基因BTG4。通过网站数据库下载患者临床资料，利用SPSS23.0软件进行统计分析。过滤策略：去除正常和无临床信息的胃癌患者。采用log₂（数值+1）计算BTG4 mRNA表达水平。

1.2 实验方法

1.2.1 临床资料

收集2012年1月至2015年1月锦州医科大学附属第一医院胃腺癌患者组织（n = 457）、正常黏膜组织（n = 243，距癌组织≥4 cm处获取）及其临床资料。其中女86例，男228例；年龄24~87岁，平均年龄（62.1±7.2）岁。淋巴结转移212例，肝转移35例。本研究获得锦州医科大学附属第一医院伦理委员会批准（批号：202407）。临床病理分期和组织分化分别依据UICC的TNM分期标准^[6]以及Lauren和WHO分型^[7]。部分患者的临床信息未能获得，包括年龄缺失143例，性别缺失143例，肿瘤大小缺失161例，侵袭深度缺失273例，淋巴管侵袭缺失161例，静脉侵袭缺失198例，淋巴结转移缺失148例，TNM分期缺失145例。其他少量信息缺少患者比较中剔除。

1.2.2 实时PCR检测

利用Trizol试剂提取细胞总RNA，使用反转录试剂PrimeScript^TM RT reagent Kit（日本Takara公司）将获取的RNA反转录成cDNA，BTG4（正向，5’-CTAAGGACTTCTTTCTAGCAG-3’；反向，5’-GTCATCTACTATGTCTCCTCC-3’）和内参GAPDH（正向，5’-CAATGACCCCTTCATTGACC-3’；反向，5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’）依据Genbank序列进行设计，实验流程依据SYBR Premix Ex Taq^TMⅡ试剂盒（日本TaKaRa公司）使用说明进行操作。

1.2.3 Western blotting检测

胃癌细胞在含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中裂解，定量后高温变性，先采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后采取转印方式使目的蛋白迁移至PVDF膜，4%脱脂奶粉封闭，兔宿主的抗BTG4（美国Proteintech公司；1∶500）和鼠抗GAPDH（美国Proteintech公司；1∶1 000）一抗孵育60 min，室温下用抗兔或抗鼠的IgG-HRP二抗孵育50 min，孵育过程中使用TBST清洗PVDF膜4次，4 min/次，清洗完毕后使用ECL-Plus检测试剂盒检测。

1.2.4 组织芯片制备和免疫组化染色

将胃癌及癌旁组织制作成组织芯片后HE染色，选取典型组织结构区域利用AZUMAYA组织芯片机（日本KIN-1公司）制作48阵列组织芯片（2 mm），然后制成4 μm厚度的切片备用。切片先进行脱腊、水化，将切片浸没于Tris-EDTA抗原修复液中修复17 min，采用9%H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，牛血清白蛋白V封闭非特异性着色。使用抗兔BTG4抗体（美国Proteintech公司；1∶80）孵育2 h，抗兔HRP二抗孵育22 min。此过程均使用间歇照射微波炉辅助^[2]，不同抗体孵育间歇使用PBS清洗，最后进行DAB显色和Mayer’s苏木素复染，切片脱水、透明、封片后镜下观察。以不进行一抗孵育作为阴性对照。BTG4定位于细胞质，在镜下随机选择8个视野并计数120个细胞，BTG4表达判定标准：0%~5%，阴性；≥6%，阳性。

1.3 统计学分析

利用SPSS 23.0软件进行统计分析，计量资料采用x±s表示，2组比较采用t检验。使用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间生存率差异比较采用log-rank分析，影响生存的多变量分析采用Cox风险比率回归模型。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 胃癌患者BTG4 mRNA的表达及其与预后的关系

Oncomine与仙桃数据库分析结果显示，胃癌中BTG4 mRNA表达低于正常组织（图 1A、1B，P < 0.05）。实时PCR结果显示，胃癌中BTG4 mRNA表达低于正常组织（图 1C，P < 0.05），与数据库分析结果一致。TCGA数据库分析结果显示，BTG4 mRNA表达与胃癌患者总生存率呈负相关（图 1D，P < 0.05）。

Kaplan-Meier分析结果显示，胃癌患者BTG4表达与总体生存率和无进展生存率呈负相关（图 1E）；按照性别、T分期、M分期和Her2状态分层也得到相同的结果（均P < 0.05），N₀、N_1-3、N₁、TNM Ⅰ期、Ⅲ期、弥漫型胃癌以及仅手术治疗患者BTG4 mRNA表达与总体生存和无进展生存呈负相关（均P < 0.05，见表 1）。TCGA数据库多因素分析显示，年龄小、远处转移及BTG4高表达是胃癌患者不良预后的独立危险因素（均P < 0.05）。见表 2。

2.2 胃腺癌中BTG4蛋白表达及其与临床各项指标的关系

Western blotting结果显示，与正常组织（2.41±0.71）比较，胃腺癌组织（0.33±0.24）中BTG4的表达显著降低（P < 0.001），见图 2。

免疫组化染色显示，BTG4蛋白定位于浅表肠化生黏膜上皮细胞和胃腺癌细胞质中（图 3）。BTG4表达结果显示，胃炎和肠上皮化生（20.6%，50/243）、原发胃腺癌（59.5%，272/457）中BTG4阳性表达比较有统计学差异（P < 0.05，表 3）。BTG4阳性表达与患者各项临床指标关系的分析结果显示，BTG4阳性表达女性多于男性（P < 0.05），但与年龄、肿瘤大小、肿瘤侵袭深度、淋巴和静脉侵袭、淋巴结转移、TNM分期和Lauren分型均不相关（均P > 0.05），见表 4。BTG4阳性表达乳头状腺癌高于黏液腺癌（P < 0.05），高分化腺癌高于中分化腺癌（P < 0.05，表 5）。

3 讨论

PASTERNAK等^[8]证明了BTG4-CAF1复合物能使哺乳动物母体的mRNA降解进而诱导卵细胞的有丝分裂阻滞于中期。BTG4蛋白耗尽的卵子在受精前会自发进入细胞分裂后期。另外，BTG4通过抑制后期促进复合物/细胞周期体（APC/C）的形成来防止有丝分裂进入后期。这些结果表明BTG4可能阻断卵母细胞或卵子的有丝分裂进程。研究^[9]表明，胃癌细胞中BTG4过表达可以显著抑制细胞增殖。另外，乳腺癌、宫颈癌和子宫内膜癌中BTG4 mRNA表达与其启动子甲基化呈负相关^[10]，细胞实验^[11]证明CpG岛的甲基化与BTG4的转录沉默有关，BTG4过表达抑制了结直肠癌细胞的集落形成。胃癌、结直肠癌、乳腺癌和肺癌中BTG4表达下调^[10-12]，本研究结果显示，与正常组织比较，胃癌中BTG4 mRNA和蛋白表达水平均显著下调（P < 0.05），提示BTG4下调可能参与了胃癌的发生，但其与甲基化表观遗传学改变的关系需要进一步论证。免疫组化结果显示，胃炎、肠上皮化生、胃癌中BTG4阳性表达水平呈逐步升高趋势，与实时PCR及Western blotting结果及以往研究结果不一致，这可能与BTG4在基质细胞中的表达和统计学方法有关；基因的选择性表达导致了腺体和基质细胞中BTG4表达的差异^[13]。

前期研究^[10]结果显示，BTG4 mRNA表达与乳腺癌患者T分期和M分期呈负相关，与子宫内膜癌患者肿瘤侵袭、临床分期、低体重指数、不良分化呈负相关，与卵巢癌的总体生存呈现负相关。本研究结果显示，BTG4 mRNA表达与胃癌患者总生存和无进展生存呈负相关，提示BTG4 mRNA高表达可以预测胃癌患者预后不良，与以往研究结果类似。另外，本研究结果显示，胃乳头状腺癌BTG4阳性表达高于黏液腺癌，高分化腺癌BTG4阳性表达高于中分化腺癌，提示BTG4表达与胃癌组织分化程度密切相关。BTG家族的另一个成员BTG2在用视黄醛诱导HL-60早幼粒细胞终末分化时，会进行重新定位。结合本研究结果，推测调节定位可能是BTG4在肿瘤细胞不同分化阶段调控相关基因转录的重要因素，同时也影响细胞周期的进程^[14]。

综上所述，BTG4在胃癌组织中低表达，其表达水平与胃癌患者总体生存负相关；BTG4阳性表达与胃癌的发生和发展密切相关。因此，BTG4可作为胃癌预后的预测因子，也可作为胃癌基因治疗的潜在靶标。本研究样本仅来源于一家医院，具有区域局限性，今后需要多中心联合，并从细胞和动物层面进行体内外实验进一步论证。