2024, Vol. 53文章信息
- 刘慧慧, 陈含希, 冷雪
- LIU Huihui, CHEN Hanxi, LENG Xue
- 基于细胞铜死亡分析香砂六君子汤减少脾虚高脂血症大鼠肝脏组织脂质沉积的作用机制
- Mechanism of Xiangsha Liujunzi decoction in reducing hepatic lipid deposition in rats with spleen-deficiency and hyperlipidemia based on cuproptosis
- 中国医科大学学报, 2024, 53(4): 289-294
- Journal of China Medical University, 2024, 53(4): 289-294
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文章历史
- 收稿日期：2023-07-24
- 网络出版时间：2024-04-10 21:39:03
引用本文 |
2. 辽宁中医药大学中西医结合学院生物化学与分子生物学教研室，沈阳 110847
2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Integrated Chinese and Western Medicine, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China
血脂异常是动脉粥样硬化疾病、冠状动脉粥样硬化性心脏病等心脑血管疾病发生的独立危险因素之一。血脂含义与中医“膏脂”类似，类属津液[1]，多由脾胃运化的水谷精微所化生。中医认为脾主运化功能，一旦脾失健运，水谷精微运化失衡，则津液失于输布，滞留血中，导致高脂血症[2]。肝脏是参与调节全身糖脂代谢的关键作用器官[3]。早期研究[4-5]发现铜与血脂代谢关系密切，同时铜代谢异常则导致肥胖。研究[6]显示肥胖患者血清中铜水平升高，表明铜与脂肪积累有关。此外，高水平铜会通过影响脂质代谢及炎症反应参与动脉粥样硬化性心血管疾病的形成和发展[7]。LIU等[8]研究发现铜代谢异常会导致肝脏HepG2细胞脂质代谢信号传导紊乱。而最新的研究[9-10]发现了一种新的细胞死亡方式——铜死亡，其代表性相关基因中铁氧还蛋白1（ferredoxin1，FDX1）与脂肪酸氧化代谢存在一定的关联性。课题组前期研究[11]证实香砂六君子汤可以缓解脾虚高脂血症大鼠肝脏脂质沉积的作用，本研究在前期基础上，从肝脏细胞铜死亡角度探讨香砂六君子汤减少脾虚高脂血症大鼠肝脏组织脂质沉积的作用机制，旨在丰富脾主运化理论科学内涵，为“从脾论治”脂代谢异常类疾病提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物与主要试剂、仪器健康SPF级SD大鼠18只，体重180~220 g，购于辽宁长生生物技术股份有限公司[质量合格证：SCXK（辽）2020-0001]，饲养于辽宁中医药大学动物实验室[SYXK（辽）2019-0004]。本研究获得辽宁中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准编号：21000042022008）。
主要试剂包括甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）检测试剂盒（单试剂GPO-PAP法）（南京建成生物工程研究所，批号：A110-1-1、A111-1-1、A113-1-1、A112-1-1），改良油红O染色试剂盒（C0158S）、Trizol（总RNA抽提试剂，R0016）、DEPC水（R0021）、BeyoRTTMⅡ cDNA合成试剂盒（D7170M，上海碧云天生物技术有限公司），RT MasterMix（N117，南京建成生物工程研究所），大鼠铜死亡PCR Array试剂盒（wc-mRNA0359-R；上海沃吉基因科技有限公司）。香砂六君子汤由木香6 g、砂仁3 g、党参12 g、茯苓12 g、白术12 g、法半夏6 g、陈皮6 g、炙甘草6 g组成，由辽宁中医药大学附属医院提供。主要仪器包括precipoint M8数字扫描显微成像系统（德国Proteintech公司）、多功能全波长酶标仪（MD，美国Molecular Devices公司）、7500实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）、nanodrop 2000超微量紫外分光光度计（德国赛默飞公司）。
1.2 动物造模、分组与取材18只健康SD大鼠适应性喂养1周后随机均分为正常组、脾虚高脂血症组、中药组，每组6只。正常组给予普通饲料，脾虚高脂血症组与中药组采用游泳力竭和高脂饲料（1.5%胆固醇、1%胆盐、3%猪油、3%花生油、5%蛋黄粉、86.5%普通饲料）喂养的复合方法造模。造模12周后灌胃干预，中药组香砂六君子汤（11.34 g·kg-1）灌胃，正常组和脾虚高脂血症组同体积的0.9%氯化钠溶液灌胃，持续4周。然后大鼠麻醉抽血（3~5 mL），3 000 r/min 15 min离心后取上清放入EP管内，-80 ℃保存；另取大鼠部分肝脏放入EP管内，-80 ℃保存，部分肝脏放入4%多聚甲醛固定液中室温保存。
1.3 方法 1.3.1 血脂检测按照血脂检测试剂盒说明书进行检测，上样后37 ℃孵育10 min，TG检测酶标仪波长546 nm，TC酶标仪波长500 nm、LDL-C酶标仪波长600 nm、HDL-C酶标仪波长600 nm，根据试剂盒说明书计算各指标水平（mmol/L）。
1.3.2 油红染色O检测脂质沉积肝脏冰冻切片（6 μm）适量染色洗涤20 s，然后吸掉染色洗涤液，滴加改良油红O染色液染色20 min，去除油红O，继续加入染色洗涤液放置30 s，然后去除染色洗涤液浸入蒸馏水中置于摇床洗涤20 s。光镜下观察各组大鼠肝组织脂质沉积情况。
1.3.3 PCR Array检测肝脏铜死亡相关基因表达取肝脏组织进行常规RNA提取，紫外分光光度计测定260 nm及280 nm吸光度（optical density，OD）值，计算RNA的浓度和纯度。取0.5 μg RNA按照PCR Array试剂盒说明书进行操作。采用2-ΔΔCt计算基因表达量。
1.3.4 荧光定量qPCR验证基因表达使用Primer5软件设计扩增基因引物，引物序列：DLD，正向5’-GACGGCCCTTTACGCAGAAT-3’，反向5’-GACCAGCA ACCACATCTCCA-3’；GLS，正向5’-GTCTGGAGGGA AGGTTGCTG-3’，反向5’-ATGCCTTTGCCCATCTAC GG-3’。按照WCGENE mRNA cDNA合成试剂盒及WCGENE mRNA qPCR试剂盒进行操作，采用2步法，qPCR反应条件95 ℃预变性30s，循环扩增40个循环（95 ℃ 5 s→60 ℃ 30 s→95 ℃ 15 s→60 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s），采用2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。
1.4 统计学分析应用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料采用x±s表示，多组比较采用ANOVA单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 香砂六君子汤对大鼠血脂水平影响与正常组比较，脾虚高脂血症组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平显著升高，HDL-C水平显著降低（均P < 0.01）。与脾虚高脂血症组比较，中药组TG、TC、LDL-C水平显著降低，HDL-C水平显著升高（均P < 0.01），见表 1。
| Group | n | TG | TC | HDL-C | LDL-C |
| Control | 6 | 1.32±0.01 | 0.49±0.01 | 1.41±0.02 | 1.40±0.04 |
| SDH | 6 | 1.59±0.031） | 0.74±0.031） | 0.85±0.111） | 1.88±0.041） |
| TCM | 6 | 1.37±0.012） | 0.55±0.012） | 1.13±0.032） | 1.57±0.062） |
| 1）P < 0.01 vs. control group；2）P < 0.01 vs. SDH group. SDH，spleen-deficiency and hyperlipidemia；TCM，traditional Chinese medicine. | |||||
2.2 香砂六君子汤对大鼠肝脏脂质沉积影响
与正常组比较，脾虚高脂血症组大鼠肝细胞脂质沉积明显，出现大量脂滴，细胞空隙较大。与脾虚高脂血症大鼠比较，中药组肝细胞脂质沉积明显减弱，脂滴数量减少，细胞排列紧密程度增加，见图 1。
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| A，control group；B，spleen-deficiency and hyperlipidemia group；C，TCM group. 图 1 各组大鼠肝脏油红O染色形态学变化×400 Fig.1 Morphological changes in liver oil red O staining in each group ×400 |
2.3 各组大鼠肝脏组织铜死亡相关基因检测结果
PCR Array检测结果显示，共检测出11个铜死亡相关基因。与正常组比较，脾虚高脂血症组的差异表达基因为Atp7b、Dlat、Dld、Gls、Lias、Pdha1、Slc31a1（均P < 0.05）；与脾虚高脂血症组比较，中药组的差异表达基因为Dld、Fdx1、Gls、Lias、Pdha1、Slc31a1（均P < 0.05）。2个比较组中共同的差异表达基因为Dld、Gls、Lias、Pdha1、Slc31a1。此外，正常组与脾虚高脂血症组、脾虚高脂血症与中药组之间比较，表达倍数均上调≥1倍或下调≤1倍的基因为Cdkn2a、Dld、Gls。2种比较结果取交集，共同的差异表达基因为Dld、Gls。见表 2、图 2。
| Group | Atp7b | Dlat | Dld | Fdx1 | Gls | Lias |
| Control | 0.050±0.001 | 0.068±0.003 | 0.415±0.016 | 1.843±0.104 | 0.011±0.003 | 0.051±0.004 |
| SDH | 0.042±0.0041） | 0.085±0.0022） | 0.213±0.0133） | 2.076±0.165 | 0.022±0.0031） | 0.059±0.0031） |
| TCM | 0.035±0.005 | 0.090±0.008 | 0.557±0.0124） | 2.734±0.0345） | 0.008±0.0015） | 0.045±0.0015） |
| Group | Lipt1 | Mtf1 | Pdha1 | Pdhb | Slc31a1 | |
| Control | 0.005±0.000 | 0.050±0.006 | 0.150±0.002 | 0.357±0.042 | 0.320±0.008 | |
| SDH | 0.004±0.001 | 0.043±0.002 | 0.123±0.0013） | 0.459±0.073 | 0.415±0.0232） | |
| TCM | 0.004±0.001 | 0.043±0.002 | 0.204±0.0114） | 0.393±0.014 | 0.353±0.0136） | |
| 1）P < 0.05，2）P < 0.01，3）P < 0.001，vs. control group；4）P < 0.001，5）P < 0.01，6）P < 0.05，vs. SDH group. SDH，spleen-deficiency and hyperlipidemia；TCM，traditional Chinese medicine. | ||||||
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| A，control group vs. spleen-deficiency and hyperlipidemia group；B，spleen-deficiency and hyperlipidemia group vs. TCM group. 图 2 大鼠铜死亡相关基因相对表达倍数比较（fold值） Fig.2 Relative expression multiples of cuproptosis-related genes in rats (fold value) |
2.4 荧光定量qPCR验证结果
结果显示，与正常组比较，脾虚高脂血症组Dld mRNA表达降低（P < 0.01）；与脾虚高脂血症组比较，中药组Dld mRNA表达升高（P < 0.01）且与芯片结果一致。与正常组比较，脾虚高脂血症组Gls mRNA表达升高（P < 0.05）；与脾虚高脂血症组比较，中药组Gls mRNA表达差异无统计学意义（P > 0.05），与芯片结果不一致，见表 3。
| Group | n | DLd mRNA | Gls mRNA |
| Control | 3 | 1.000±0.030 | 0.008±0.001 |
| SDH | 3 | 0.330±0.0331） | 0.015±0.0032） |
| TCM | 3 | 0.570±0.0163） | 0.016±0.002 |
| 1）P < 0.01，2）P < 0.05 vs. control group；3）P < 0.01 vs. SDH group. SDH，spleen-deficiency and hyperlipidemia；TCM，traditional Chinese medicine. | |||
3 讨论
本研究结果显示，脾虚高脂血症组大鼠血脂代谢异常，肝脏出现明显的脂质沉积，大量脂滴出现；香砂六君子汤干预后，大鼠血脂代谢指标TG、TC、HDL-C、LDL-C明显改善，肝脏脂质沉积以及脂滴现象明显缓解，与之前研究结果[11-12]一致。PCR Array检测出11个肝脏铜死亡相关基因。结果显示，与正常组比较，脾虚高脂血症组大鼠肝脏铜死亡相关差异表达基因7个（Atp7b、Dlat、Dld、Gls、Lias、Pdha1、Slc31a1）；与脾虚高脂血症组比较，中药组铜死亡相关差异表达基因6个（Dld、Fdx1、Gls、Lias、Pdha1、Slc31a1）。其中共同的差异表达基因5个（Dld、Gls、Lias、Pdha1、Slc31a1）。另外，脾虚高脂血症组与正常组、中药组与脾虚高脂血症组差异表达倍数比较，均发生上调≥1倍或下调≤1倍的基因共3个（Cdkn2a、Dld、Gls），两种比较结果取交集，共同的差异表达基因为Dld、Gls。荧光定量qPCR验证结果显示，Dld mRNA表达与芯片结果一致。
Dld分布于动植物线粒体中，为线粒体二氢硫辛酸脱氢酶，是一种同型二聚体黄素依赖酶，可催化NAD+依赖的二氢脂酰胺氧化[13]，在葡萄糖代谢和线粒体ATP的级联生产过程中发挥作用[14]，是线粒体三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环中重要的物质之一，参与了几个关键的代谢酶复合物（丙酮酸脱氢酶复合物、α-酮戊二酸脱氢酶复合物、支链-酮酸脱氢酶复合物）和甘氨酸裂解系统的形成[15]。Dld参与生物体的新陈代谢，与多种疾病的发生机制密切相关，研究[14]表明抑制Dld可以缓解糖尿病，作用机制是长期抑制Dld可以减弱糖尿病的氧化应激反应；Dld可作为2型糖尿病抗氧化应激的保护途径。在秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型中，可以通过提高全身葡萄糖含量来诱导人Tau蛋白磷酸化，从而抑制Dld活性[16]。此外，在中风刺激下Dld缺陷小鼠模型表现出脑损伤增加[17]。
传统中医并无“高脂血症”病名，古代的“膏脂”与现代的血脂含义颇为相似[18-19]。血脂异常发生的病因多与中医“脾”密切相关。脾失健运是血脂代谢异常引起疾病的关键病机[18-20]，可见健脾化痰是防治血脂异常疾病的关键。香砂六君子汤为健脾化痰的经典方剂[21]，同时，课题组前期研究[11-12]发现香砂六君子汤有改善脾虚高脂血症大鼠血脂代谢异常的疗效。
脾运化水谷功能与线粒体能量转化功能颇为一致，脾主运化的关键是线粒体内的生物氧化过程[22]，水谷精微物质在体内的吸收需要脾将水谷精微化为气、血、精、津液等物质以营养全身，经历的物质代谢转化生成能量的过程与线粒体通过TCA循环进行物质代谢和相互转化的过程一致[23]。可见脾主运化的细胞生物学基础之一可能是线粒体在体内发挥的物质能量代谢过程[24]，脾主运化在体内的生物基础可体现在线粒体的TCA循环中[25]。最新研究[9]发现铜离子可以通过影响线粒体TCA循环，引起脂酰化蛋白的聚集、铁硫簇蛋白发生不稳定性，最终产生蛋白毒性应激反应，从而诱发不依赖细胞凋亡过程的新死亡形式——铜死亡。而铜离子也是心血管疾病、糖尿病等代谢性疾病发病的关键[26]。
肝脏是参与人体代谢最重要的器官，肝细胞中线粒体占比较多，而线粒体是能量代谢的中心，脾虚的重要病机之一是线粒体功能障碍[27]，依据中医藏象学说，肝脏可归属于中医的脾藏[28]，故脾虚大鼠肝脏常出现严重的线粒体损伤[29-30]。而铜死亡相关基因均参与了线粒体TCA循环过程，可见新的细胞调节性死亡方式与TCA循环代谢紊乱有关。
综上所述，肝脏铜死亡相关基因表达异常极有可能是血脂代谢异常的潜在机制，也可能是香砂六君子汤防治血脂代谢异常的重要作用靶点。脾主运化的正常发挥与线粒体能量代谢的功能正常行使密不可分，随着对铜死亡的进一步认识，未来将更有助于发现铜死亡相关基因与血脂代谢异常类疾病之间的关系及其潜在分子机制，对于明确脾-线粒体关系及铜死亡机制，筛选治疗血脂代谢异常类疾病的相关药物具有一定价值。
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