中国医科大学学报  2024, Vol. 53 Issue (3): 207-212

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孙卢浩然, 卢敏
SUN Luhaoran, LU Min
二氢青蒿素结合SERCA2b诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡的机制研究
Mechanism of dihydroartemisinin binding SERCA2b and inducing apoptosis in colorectal cell HCT-116
中国医科大学学报, 2024, 53(3): 207-212
Journal of China Medical University, 2024, 53(3): 207-212

文章历史

收稿日期:2023-08-03
网络出版时间:2024-03-04 17:06:18
二氢青蒿素结合SERCA2b诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡的机制研究
孙卢浩然1 , 卢敏2     
1. 中国医科大学附属第一医院泌尿外科, 沈阳 110001;
2. 中国医科大学附属第一医院肛肠外科, 沈阳 110001
摘要目的 探讨二氢青蒿素(DHA)与肌浆/内质网钙ATP酶(SERCA)的结合位点及其通过线粒体途径诱导人结肠癌HCT-116细胞凋亡的作用机制。方法 分别于不同浓度(0,10,20,40 μmol/L)DHA环境中培养HCT-116细胞24 h后,用Western blotting检测细胞中SERCA2蛋白表达水平;CCK-8法检测细胞增殖情况;行Hoechst核染色;用JC-1探针检测细胞线粒体膜电位。通过LeDock分子对接方法,预测DHA与SERCA的结合位点。基于生物膜干涉技术,将合成的Ile315与Thr316位点突变后的SERCA2b突变蛋白和非突变蛋白分别与小分子DHA进行结合检测。结果 Western blotting与CCK-8检测结果显示,随着DHA浓度升高,SERCA2蛋白表达水平显著下降,细胞增殖显著降低,并呈剂量相关(P < 0.01)。Hoechst核染色显示,DHA诱导了HCT-116细胞核变圆、固缩。JC-1探针检测结果表明,在DHA处理4 h内,线粒体膜电位逐渐降低,其后线粒体膜电位则出现明显降低。分子对接预测提示DHA与Thr316形成氢键相互作用,与Ile315则有疏水相互作用。进一步的生物膜干涉技术提示DHA与SERCA2b非突变蛋白结合信号良好,而与Ile315与Thr316位点突变后的SERCA2b突变蛋白结合信号较差。结论 DHA可直接与SERCA2b的Ile315与Thr316位点结合,并通过线粒体途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡。
Mechanism of dihydroartemisinin binding SERCA2b and inducing apoptosis in colorectal cell HCT-116
SUN Luhaoran1 , LU Min2     
1. Department of Urology, The First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China;
2. Department of Colorectal Surgery, The First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, China
Abstract: Objective To investigate the binding sites of dihydroartemisinin (DHA) and sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) and explore the mechanisms underlying apoptosis induction in HCT-116 colon cancer cells through the mitochondrial pathway. Methods HCT-116 cells were cultured in DHA concentrations of 0, 10, 20, 40 μmol/L. After 24 h of culture, Western blotting assessed SERCA concentration, CCK-8 measured cell proliferation, Hoechst nuclear staining examined cell apoptosis, JC-1 probe evaluated mitochondrial membrane potential. LeDock molecular docking predicted DHA and SERCA binding sites. Synthetic SERCA2b mutated and non-mutated proteins at Ile315 and Thr316 sites were combined with small molecule DHA using biofilm interference technology. Results Western blotting revealed a significant decrease in SERCA2 protein levels with increasing DHA concentration. CCK-8 demonstrated a statistically significant decrease in cell proliferation with increasing DHA concentration (P < 0.01). Hoechst nuclear staining illustrated DHA-induced rounding and pyknosis of HCT-116 cell nuclei compared to the control group. DHA gradually decreased mitochondrial membrane potential within the first 4 h of treatment, starting from 5 h, followed by a sustained reduction. Molecular docking predicted a hydrogen bond with Thr316 and a hydrophobic interaction with Ile315. Biofilm interference techniques indicated robust binding of DHA to non-mutated SERCA2b protein, while binding to the SERCA2b mutant protein at Ile315 and Thr316 sites was poor. Conclusion DHA directly binds to the Ile315 and Thr316 sites of SERCA2b, inducing apoptosis in colon cancer cells HCT-116 through the mitochondrial pathway.

结肠癌是一种常见的恶性肿瘤,死亡率较高[1-2]。常规化疗药物耐药是结肠癌预后差的重要原因[3-4]。二氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对多种恶性肿瘤具有抗肿瘤作用[5-8]。前期研究[9]证实,DHA可通过内质网凋亡途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡,肌浆/内质网钙ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase,SERCA)2b活性下降,但其具体机制尚不明确。SERCA在维持Ca2+稳态中起关键作用,并可通过下游多个通路诱导细胞凋亡,其抑制与否对细胞的生死决策有重要的影响[10]。多种天然药物提取物抗癌作用的靶点也被证实为SERCA,如金丝桃素[11]、姜黄素[12]等。DHA亦可调控细胞内质网和细胞质Ca2+失衡,引起内质网应激反应诱导细胞凋亡[13-14],因此,DHA可能也是通过作用于SERCA,诱导结肠癌细胞凋亡,具体机制有待阐明。本研究首次采用LeDock分子对接方法及生物膜干涉技术,预测并证实DHA与SERCA2b的结合及其结合位点,揭示了DHA通过线粒体途径诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡。

1 材料与方法 1.1 细胞及处理

人结肠癌细胞HCT-116购自中国科学院上海细胞库。用含10 %胎牛血清(美国Hyclone公司)、1 %青链霉素的McCoy’s 5A培养基(美国Gibco公司),在37 ℃、5 %CO2培养箱中培养。常规换液、传代。当细胞生长至80%~90%,分别加入不同浓度(10、20、40 μmol/L)DHA处理,并设置DMSO处理的对照组。

1.2 方法

1.2.1 SERCA活性检测

通过差速离心提取微粒体蛋白质。用BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)测定蛋白浓度,根据SERCA活性检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书检测SERCA活性,1 h后酶标仪读取600 nm光密度值。每个点重复检测3次。SERCA活性以每毫克微粒体蛋白每小时产生无机磷酸盐的量表示。

1.2.2 Western blotting检测

通过细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)裂解提取总蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度,上等量蛋白样品行SDS-PAGE凝胶电泳,电转移至PVDF膜(美国Millipore公司)。室温条件下,用5 %脱脂牛奶封闭PVDF膜1 h,加入小鼠SERCA2单克隆抗体(sc-376235,美国Santa Cruz Biotechnology公司)4 ℃孵育过夜。洗膜后,用二抗辣根过氧化物酶标记的抗鼠IgG抗体37 ℃孵育45 min。采用ECL试剂盒(美国Millipore公司)显像。β-actin和COX-Ⅳ作内参照。

1.2.3 流式细胞仪检测

按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)说明书检测。分别将HCT-116细胞培养于含0、10、20、40 μmol/L DHA的培养基中24 h。用胰酶消化细胞,待细胞变圆脱落后,加入完全培养基终止消化,PBS洗涤2次,并进行细胞计数。加入500 μL Bin-ding buffer重悬细胞,加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI混匀,室温避光反应15 min。行流式细胞仪检测,通过FL1检测Annexin V-FITC,FL2检测PI。

1.2.4 细胞增殖检测

用CCK-8检测试剂盒分析细胞增殖情况。将细胞按2×104/孔接种至96孔板中,分别用不同浓度DHA(10、20、40 μmol/L)处理。每孔加入CCK-8试剂10 μL,37 ℃孵育1 h。用酶标仪检测450 nm处吸光度值。

1.2.5 Hoechst核染色

将细胞接种至12孔板,待生长至亚融合状态后,用10、20、40 μmol/L DHA处理,37 ℃培养24 h后,用Hoechst33342染色,荧光显微镜下观测细胞凋亡。

1.2.6 线粒体膜电位检测

在0~6 h时分别用40 μmol/LDHA处理HCT-116细胞,然后用1 mg/mL JC-1探针(江苏凯基生物技术股份有限公司)37 ℃避光孵育15 min。细胞洗涤后,通过IX73显微镜观察。通过流式细胞仪在530 nm(FL1通道)和590 nm(FL2通道)检测荧光强度,通过红色荧光(FL2通道)与绿色荧光(FL1通道)的比值计算线粒体膜电位(ΔΨ)。

1.2.7 DHA与SERCA2b相互作用位点的预测

根据PDB数据库(https://www.rcsb.org/)信息,蛋白质SERCA2b的PDB ID为6LN6。使用LeDock软件(http://www.lephar.com/index.htm)进行互作位点预测。每个结合位点生成100个构象,以RMSD=1.0 Å进行聚类,其他参数默认设置。对接结果选择结合能最低的构象,然后选择结合能最低的构象,用PLIP和PyMOL进行结合位点的分析。

1.2.8 SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体的重组蛋白表达

为了达到位点研究的目的,对预测的位点进行突变,将SERCA2b(314-756aa)突变体的氨基酸Ile315和Thr316突变为对蛋白功能及结构影响较小的丙氨酸[8]。为成功表达SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体蛋白,利用基因合成技术合成了SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体基因,插入his标签,将2段基因分别连接到pET30a表达载体。利用大肠杆菌表达体系对2种蛋白分别进行表达。表达成功后,利用镍柱对2种重组蛋白进行纯化。对纯化后的蛋白进行复性,并进行SDS-PAGE检测,确定其浓度和纯度。

1.2.9 SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体与DHA结合的检测

利用生物膜干涉技术分别检测SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体与DHA之间的结合。拟合模型选择1∶1,即1个重组蛋白结合1个小分子DHA,拟合方式global,即把5个浓度作为1组关联进行分析。

1.3 统计学分析

采用Data Analysis software 9.0进行统计学分析,计量资料用x±s表示,采用Student’s t检验比较组间差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 DHA抑制SERCA活性的同时降低SERCA2蛋白的表达水平

用不同浓度DHA(0、10、20、40 μmol/L)处理HCT-116细胞24 h,结果显示,细胞中SERCA活性减弱(图 1A);Western blotting结果显示,0、10、20 μmol/L DHA不影响SERCA2蛋白表达,而40 μmol/L DHA明显抑制了SERCA2蛋白表达(图 1B)。提示高浓度DHA可影响HCT-116细胞中SERCA2蛋白的表达。

A, SERCA activity is determined by the amount of inorganic phosphate produced per hour per milligram of microsomal protein; B, Western blotting mea-sured SERCA2 protein levels and quantified them by density values, β-actin as an internal reference, and the data were expressed as x±s deviation of three independent replicates. *P < 0.05 vs. 0 μmol·L-1 DHA. 图 1 DHA抑制HCT-116细胞SERCA活性及其蛋白表达水平 Fig.1 DHA inhibits SERCA activity and reduces the expression of SERCA2 protein in HCT-116 cells

2.2 DHA通过抑制SERCA活性抑制HCT-116细胞增殖

CCK-8检测结果显示,DHA处理48~72 h后,HCT-116细胞增殖活性显著降低,并呈剂量相关性(P < 0.01)(图 2A)。Hoechst核染色显示,与对照组相比,DHA诱导HCT-116细胞膜通透性增加,细胞核变圆、固缩,染色质凝缩,即出现凋亡细胞特征(图 2B)。

A,after exposed to progressively increasing concentrations(0,10,20,40 μmol/L)of DHA,HCT-116 cell viability was assessed using CCK-8. *P < 0.01 vs. 0 μmol/L DHA after 48 h treatment,**P < 0.01 vs. 0 μmol/L DHA after 72 h treatment;B,after co-incubating HCT116 cells with different concentrations of DHA for 24 h,Hoechst 33342 staining was performed and observed by fluorescence microscopy to detect apoptosis(×10). Arrows indicate apoptotic cells. 图 2 DHA诱导的抗增殖及促凋亡作用 Fig.2 DHA-induced antiproliferative and pro-apoptosis effects

2.3 DHA诱导细胞线粒体膜电位降低

JC-1的单体形式发绿色荧光,而在膜极化的线粒体中形成聚合体(即线粒体膜电位增加),并发红色荧光。用DHA处理HCT-116细胞,随着时间推移,细胞内红色荧光消失(图 3A),提示线粒体膜电位下降。流式细胞分析结果显示,在DHA处理的最初数小时内,线粒体膜电位稍下降,而在5 h后,超过半数细胞线粒体膜电位明显下降(图 3B)。

A, fluorescence microscopy (×10);B, analysis of results, data expressed as x±s deviation of three independent replicates. *P < 0.05, **P < 0.01, compared with 0 h. 图 3 DHA诱导线粒体膜电位下降 Fig.3 DHA-induced decrease in mitochondrial membrane potential

2.4 SERCA2b与DHA相互作用位点的预测

通过软件对最小结合能构象进行分析,发现DHA与SERCA2b的Arg246、Gln250、Thr316形成氢键相互作用,与Glu58、Asp59、Pro312和Ile315有疏水相互作用。预测DHA和SERCA之间的结合模式见图 4

图 4 DHA和SERCA之间结合模式的预测 Fig.4 Predicted binding patterns between dihydroartemisinin and SERCA

2.5 SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体的重组蛋白表达

用最大的非跨膜相aa314-756对SERCA2b蛋白进行相互作用位点研究,结果显示,SERCA2b(314-756aa)包含了Thr316和Ile315这2个结合位点,因此,以Thr316和Ile315为预测结合位点进行突变研究。在SERCA2b(314-756aa)的突变体中,为了避免干扰蛋白质结构,将Thr316和Ile315突变成为丙氨酸(图 5)。

M, marker; 1, SERCA2b (314-756aa) wild-type protein recombinant protein; 2, SERCA2b (314-756aa) mutant recombinant protein. 图 5 蛋白质质量表达纯化凝胶图 Fig.5 Protein mass expression purification gel diagram

2.6 SERCA2b(314-756aa)野生型及突变体与DHA之间的结合检测结果

首先,检测SERCA2b(314-756aa)野生型与DHA之间的结合。结果如图 6A所示,随着分析物浓度的增加,结果相应增加,即呈显著正相关,表明SERCA2b(314-756aa)野生型蛋白和小分子DHA之间存在相互作用。然后,检测了SERCA2b(314-756aa)突变体与DHA之间的结合。结果如图 6B所示,随着分析物浓度的增加,结果未显示相关性,意味着SERCA2b(314-756aa)突变体蛋白和小分子DHA之间无相互作用。证明Thr316和Ile315有可能是SERCA2b(314-756aa)与小分子DHA之间相互结合的关键性氨基酸位点。

A, interaction between wild-type SERCA2b and dihydroartemisinin; B, interaction between mutant SERCA2b and dihydroartemisinin. 图 6 SERCA2b和DHA之间的相互作用 Fig.6 Interaction between SERCA2b and dihydroartemisinin

3 讨论

DHA可抑制多种肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡。研究[9]表明,DHA可抑制SERCA2b,导致肿瘤细胞内质网中Ca2+紊乱,从而通过内质网、线粒体、死亡受体等多种途径诱导细胞凋亡。

为探讨DHA在HCT-116细胞线粒体途径凋亡中的作用,本研究首先使用流式细胞仪检测DHA处理后HCT-116细胞的凋亡情况,并通过Western blotting检测SERCA2b蛋白的表达。结果发现,DHA抑制了SERCA2b活性并降低了SERCA2b蛋白的表达水平,促进了HCT-116细胞凋亡,且与浓度呈正相关。

为了阐明线粒体参与DHA诱导的结肠癌细胞凋亡机制,本研究检测了DHA处理后线粒体膜电位的变化,发现DHA作用细胞5 h时线粒体膜电位急剧下降。说明线粒体功能障碍是DHA诱导结肠癌细胞凋亡的机制之一。DHA诱导的线粒体膜电位降低发生在DHA暴露后相对较早的时期。本研究还发现线粒体功能紊乱在DHA促进HCT-116细胞的凋亡中起关键作用。线粒体通路是典型的细胞凋亡通路。线粒体膜电位丧失导致细胞色素c从线粒体内释放至细胞质中,激活caspase-8和caspase-9,进而激活细胞凋亡的执行者caspase-3[15]。前期研究[16]发现,DHA可能导致HCT-116细胞线粒体膜电位崩溃,释放细胞色素c,增加Bax/Bcl2比率,激活caspas-3、caspas-8和caspas-9,证明线粒体参与了DHA诱导的结肠癌细胞的凋亡。

SERCA包含3种亚型,通过水解ATP,将细胞质中Ca2+转移至内质网腔内[17]。结肠癌细胞调控Ca2+平衡的主要是SERCA2b。SERCA2b是一种多跨膜蛋白,很难在体外表达[6],这也限制了DHA与SERCA具体结合位点的研究。为进一步确定DHA调控SERCA2b活性的靶点,本研究选取SERCA2b最长的一段Topological domain(314-756aa),该段属于细胞质区域。首先,应用生物膜干涉技术[7]检测并确认了SERCA2b和DHA间的结合。其次,应用LeDock分子对接方法预测DHA与SERCA的结合位点[8, 12],发现处于314-756aa段的Ile315和Thr316是可能的结合位点。进一步对Ile315和Thr316进行丙氨酸位点突变并表达突变蛋白,再次通过Octet平台基于生物膜干涉技术[9-11],对合成的Ile315与Thr316位点突变后的SERCA2b突变蛋白和非突变蛋白分别与小分子DHA进行结合检测,结果证实突变型SERCA2b与DHA之间无相互作用,提示DHA可与SERCA2b的Ile315和Thr316位点直接结合。

综上所述,本研究结果显示,DHA可直接结合SERCA2b的Ile315和Thr316位点,通过增加HCT-116细胞内Ca2+浓度,导致Ca2+紊乱,继而通过线粒体途径诱导细胞凋亡。未来将尝试合成SERCA2b全蛋白,并进一步明确SERCA2b与DHA的全部结合位点及其上下游调控机制,以期为DHA抗肿瘤研究提供新思路,开辟新途径。

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