中国医科大学学报  2024, Vol. 53 Issue (3): 198-206

文章信息

夏书官, 王声, 任阳光, 田艳艳, 左永刚
XIA Shuguan, WANG Sheng, REN Yangguang, TIAN Yanyan, ZUO Yonggang
circRNA TCF25靶向miR-128b对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响
Effect of circular RNA transcription factor 25-targeting microRNA-128b on the proliferation and apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells
中国医科大学学报, 2024, 53(3): 198-206
Journal of China Medical University, 2024, 53(3): 198-206

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收稿日期:2023-04-19
网络出版时间:2024-03-05 15:43:14
circRNA TCF25靶向miR-128b对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响
河南大学淮河医院甲状腺乳腺外科, 河南 开封 475000
摘要目的 探究环状RNA(circRNA)转录因子25(TCF25)靶向微RNA-128b(miR-128b)对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。方法 收集人乳腺癌细胞MCF-7培养至对数生长期,将MCF-7细胞随机分为空白组(未转染)、si-NC组(转染si-NC)、si-circRNA TCF25组(转染si-circRNA TCF25)、pcDNA-circRNA TCF25组(转染pcDNA-circRNA TCF25)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-128b mimic组(转染miR-128b模拟物)、miR-128b inhibitor组(转染miR-128b抑制剂)、pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组(转染pcDNA-circRNA TCF25和miR-128b模拟物),每组6个复孔。转染48 h后,荧光定量PCR(RT-qPCR)检测各组细胞中circRNA TCF25、miR-128b表达;RNase R酶消化实验进行环状RNA鉴定;核浆分离法检测circRNA TCF25的亚细胞定位;噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖活力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;RT-qPCR检测磷酸酯酶与张力蛋白同源物(PTEN)、细胞增殖核抗原-67(Ki-67)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶3(caspase-3)mRNA表达;Western blotting检测PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达;双荧光素酶报告实验分析circRNA TCF25与miR-128b的靶向关系。结果 与对照组比较,circRNA TCF25的相对表达量在RNase R酶处理后并无显著变化(P > 0.05),而线性TCF25的相对表达量在经RNase R酶处理后降低(P < 0.05);circRNA TCF25在胞质中的相对表达量高于细胞核(P < 0.05)。与空白组和si-NC组比较,si-circRNA TCF25组细胞增殖活力降低,凋亡率升高,Ki-67 mRNA及蛋白表达降低,PTENcaspase-3、活化的caspase-3 mRNA及蛋白表达升高;pcDNA-circRNA TCF25组细胞增殖活力升高,凋亡率降低,Ki-67 mRNA及蛋白表达升高,PTENcaspase-3、活化的caspase-3 mRNA及蛋白表达降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。与空白组和miR-NC组比较,miR-128b mimic组细胞增殖活力降低,凋亡率升高,Ki-67 mRNA及蛋白表达降低,PTENcaspase-3、活化的caspase-3 mRNA及蛋白表达升高,miR-128b inhibitor组细胞增殖活力升高,凋亡率降低,Ki-67 mRNA及蛋白表达升高,PTENcaspase-3、活化的caspase-3 mRNA及蛋白表达降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。与pcDNA-circRNA TCF25组比较,pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞增殖活力降低,凋亡率升高,Ki-67 mRNA及蛋白表达降低,PTENcaspase-3、活化的caspase-3 mRNA及蛋白表达升高,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。双荧光素酶实验结果证实了circRNA TCF25可靶向调控miR-128b。结论 circRNA TCF25可能通过靶向抑制miR-128b表达,促进Ki-67表达,抑制PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达,发挥促进人乳腺癌细胞MCF-7增殖,抑制其凋亡的作用。
关键词环状RNA转录因子25    微RNA-128b    乳腺癌    增殖    凋亡    
Effect of circular RNA transcription factor 25-targeting microRNA-128b on the proliferation and apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells
Department of Thyroid and Breast Surgery, Henan University Huaihe Hospital, Kaifeng 475000, China
Abstract: Objective To explore the effect of circular RNA (circRNA) transcription factor 25 (TCF25)-targeting microRNA-128b (miR-128b) on the proliferation and apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells. Methods MCF-7 cells were cultured until the logarithmic growth stage. Cells were randomly divided into the blank (untransfected), si-NC (transfected si-NC), si-circRNA TCF25 (transfected si-circRNA TCF25), pcDNA-circRNA TCF25 (transfected pcDNA-circRNA TCF25), miR-NC (transfected miR-NC), miR-128b mimic (transfected miR-128b mimic), miR-128b inhibitor (transfected miR-128b inhibitor), and pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic (transfected with pcDNA-circRNA TCF25 and miR-128b mimic) groups. Each group included six multiple pores. Forty-eight hours after transfection, the expression of circRNA TCF25 and miR-128b in each group was determined using real-time reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). An RNase R enzyme digestion assay was used to identify circular RNA. Subcellular localization of circRNA TCF25 was determined through cytoplasmic-nuclear separation. Cell proliferative activity was measured using the 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay. Apoptosis was detected using flow cytometry. RT-qPCR was performed to determine the mRNA expression levels of phosphatase and tensin homolog (PTEN), proliferating nuclear antigen 67 (Ki-67), and caspase-3. Western blotting was performed to measure PTEN, Ki-67, caspase-3, and cleaved caspase-3 protein expression. The dual-luciferase reporter (DLR) assay was performed to analyze the relationship between circRNA TCF25 and miR-128b. Results Compared to the control group, the relative expression of circRNA TCF25 did not exhibit significant changes after RNase R enzyme treatment (P > 0.05), whereas that of linear TCF25 decreased after RNase R enzyme treatment (P < 0.05). The relative expression of circRNA TCF25 in the cytoplasm was higher than that in the nucleus (P < 0.05). Compared with the blank and si-NC groups, the cell proliferation activity of the si-circRNA TCF25 group decreased; the apoptosis rate increased; Ki-67 mRNA and protein expression decreased; and PTEN, caspase-3, and cleaved caspase-3 mRNA and protein expression increased. In addition, cell proliferation activity increased and apoptosis rate decreased in the pcDNA-circRNA TCF25 group. Ki-67 mRNA and protein expression were increased, and PTEN, caspase-3, and cleaved caspase-3 mRNA and protein expression decreased, with statistical significance (all P < 0.05). Compared with the blank and miR-NC groups, the cell proliferation activity of the miR-128b mimic group decreased; the apoptosis rate increased; Ki-67 mRNA and protein expression decreased; and PTEN, caspase-3, and cleaved caspase-3 mRNA and protein expression were increased, whereas the cell proliferation activity increased and apoptosis rate decreased in the miR-128b inhibitor group. Ki-67 mRNA and protein expression were increased, and PTEN, caspase-3, and cleaved caspase-3 mRNA and protein expression decreased, with statistical significance (all P < 0.05). Compared with the pcDNA circRNA TCF25 group, the cell proliferation activity of the pcDNA circRNA TCF25+miR-128b mimic group decreased; the apoptosis rate increased; Ki-67 mRNA and protein expression decreased; and PTEN, caspase-3, and cleaved caspase-3 mRNA and protein expression increased, with statistical significance (all P < 0.05). The DLR assay results confirmed that circRNA TCF25 targets miR-128b. Conclusion CircRNAs may play a key role in promoting the proliferation of MCF-7 human breast cancer cells and inhibiting their apoptosis by targeting miR-128b expression; promoting Ki-67 expression; and inhibiting PTEN, caspase-3, and cleaved caspase-3 expression.

全球癌症统计报告[1]数据显示,2020年女性乳腺癌新发病例达230万,约占新发癌症病例的11.7%,已超越肺癌居全球第一位;乳腺癌也是导致女性癌症死亡的主要原因。虽然近年来手术、放化疗、免疫治疗、靶向治疗及内分泌治疗等手段在乳腺癌治疗中取得重要进展,但仍有部分患者在治疗后出现复发、转移甚至死亡,对女性健康造成严重危害。因此,探究乳腺癌发生发展的分子机制、寻找新的分子靶点对乳腺癌的诊断治疗及预后改善有重要意义。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类通过外显子或内含子序列可变剪接形成的单链闭合环状RNA分子,可充当微RNA(microRNA,miR)的分子海绵竞争性结合miR,进而改变靶mRNA表达状态[2]。最新研究[3]表明,circRNA在乳腺癌的发生发展过程中发挥重要调控作用,并可调节乳腺癌细胞增殖、凋亡和转移等生物学过程。YIN等[4]通过体外细胞实验发现,过表达circRNA转录因子25(transcription factor 25,TCF25)可作为miR-206的海绵促进胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力。陈旭轮等[5]研究显示,circRNA TCF25可通过靶向miR-128提高膀胱癌细胞生长增殖、迁移和侵袭能力。已有研究[6]显示,过表达miR-128可通过调节磷酸酯酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)来增强乳腺癌细胞对阿霉素的敏感性。然而关于circRNA TCF25对乳腺癌细胞增殖、凋亡影响的研究尚未见报道。本研究通过体外实验探究circRNA TCF25靶向miR-128b对人乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞

人乳腺癌细胞MCF-7(美国ATCC细胞库,货号YBCC100943)。

1.1.2 药物与试剂

si-NC、si-circRNA TCF25、pcDNA-circRNA TCF25、miR-NC、miR-128b模拟物、miR-128b抑制剂、双荧光素酶报告载体均由宝生物工程(大连)有限公司设计合成。Lipofectamine 2000转染试剂盒(美国Invitrogen公司,货号11668019),RNase R酶(上海抚生实业有限公司,货号A-PJ1136),细胞核/细胞质细胞组分提取试剂盒(美国Biovision公司,货号K266-25),噻唑蓝(MTT)细胞增殖检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号M1020),凋亡检测试剂盒(美国Biogems公司,货号62700-50),Trizol总核糖核酸(RNA)提取试剂盒(上海联迈生物工程有限公司,货号LM80901B),反转录试剂盒(日本TaKaRa公司,货号RR036A),荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司,货号RR420A),二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒(美国AAT Bioquest公司,货号200619),双荧光素酶报告基因检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号D0010),兔抗人PTEN、细胞增殖核抗原-67(Ki-67)、caspase-3、活化的caspase-3、U6、β-actin单克隆抗体(美国Abcam公司,货号ab13847、ab34710、ab69949、ab26548、ab16105、ab22140),羊抗兔PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3、U6、β-actin多克隆抗体(美国Abcam公司,货号ab34106、ab22693、ab51102、ab20247、ab16419、ab10188)。

1.1.3 实验器材

S1000™ 384 Well型PCR仪(美国BIO-RAD公司),SuPerMax 3000AL型型多功能酶标仪(上海闪谱生物科技公司),Attune CytPix型流式细胞仪(美国Invitrogen公司),BPN-CRH型细胞培养箱(上海一恒科学仪器有限公司),DT-MINIE-135型电泳仪[德诺杰亿(北京)生物科技有限公司],JP-2880型凝胶成像系统(上海金鹏分析仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染和分组

将人乳腺癌细胞MCF-7于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中常规培养,每2 d换液1次。待细胞生长至对数生长期,消化并离心收集细胞,按照1.0×104/孔接种至96孔板。根据Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书分别将si-NC、si-circRNA TCF25、pcDNA-circRNA TCF25、miR-NC、miR-128b模拟物、miR-128b抑制剂、pcDNA-circ-RNA TCF25和miR-128b模拟物转染至上述细胞,分别记作si-NC组、si-circRNA TCF25组、pcDNA-circ-RNA TCF25组、miR-NC组、miR-128b mimic组、miR-128b inhibitor组和pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组,另取未转染人乳腺癌细胞MCF-7设为空白组,每组6个复孔。

1.2.2 细胞中circRNA TCF25、miR-128b表达

转染48 h后,通过Trizol总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,合成互补脱氧核糖核酸(cDNA),根据PCR试剂盒说明操作步骤检测circRNA TCF25、miR-128b相对表达量。反应体系:正向、反向引物各1 μL,Real-Time Master Mix 10 μL,cDNA 2 μL,无酶双蒸水(RNase ddH2O)补足体系至20 μL。反应条件:95 ℃预变性2 min,95 ℃变性15 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸30 s(循环40次)。circRNA TCF25,正向5’-TGAACCGATACGACAGTCC-3’,反向5’-ACGGGCATATATTACGTC-3’,产物长度146 bp;miR-128b,正向5’-AGCCACATATCAGCACTT-3’,反向5’-CTTAGCATTGAGTATATCTG-3’,产物长度206 bp;U6,正向5’-ACCGATCAGATACGAG-3’,反向5’-TGCAAACGAGTTGACGTAGT-3’,产物长度177 bp;β-actin,正向5’-GCACTAGCAGAGATCC-3’,反向5’-CATTGCACTGTCAGTA-3’,产物长度306 bp。引物均由宝生物工程(大连)有限公司设计合成。circRNA TCF25以β-actin为内参,miR-128b以U6为内参,通过2-△△Ct公式计算相对表达量。

1.2.3 RNase R酶消化实验进行circRNA鉴定

提取细胞总RNA后,将pcDNA-circRNA TCF25组分为Rnase R组(加Rnase R)和对照组(不加Rnase R),逆转录后进行荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)反应,分别检测circRNA TCF25及其线性亲本基因TCF25在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达水平,明确circRNA TCF25在人乳腺癌MCF-7细胞中的结构稳定性。其中,MCF-7正向5’-TGGCAGATCACACGTAC-3’,反向5’-AATGCCCGATATTGAGAGTCGTA-3’,产物长度187 bp。circRNA TCF25和β-actin引物及反应条件同1.2.2。

1.2.4 核浆分离法检测circRNA TCF25的亚细胞定位

根据细胞核/细胞质细胞组分提取试剂盒的说明书进行操作,对pcDNA-circRNA TCF25组人乳腺癌MCF-7细胞进行核质分离。分别提取细胞质及细胞核RNA,将其逆转录成cDNA,以β-actin为内参,采用RT-qPCR检测circRNA TCF25分别在细胞质及细胞核中相对表达量,circRNA TCF25和β-actin引物及反应条件同1.2.2。

1.2.5 细胞增殖活力检测

将各组细胞按照1.0×104/孔接种至96孔板上,分别在0、24、48、72 h时每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)继续孵育4 h,吸弃孔内上清液,每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)充分震荡溶解结晶物,通过多功能酶标仪检测490 nm处各孔的光密度(optical density,OD)值,以OD490 nm值代表细胞增殖活力。

1.2.6 细胞凋亡检测

收集各组细胞,加入0.01%的胰酶消化制成1.0×104/mL的单细胞悬液。加入磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞,离心收集细胞,加入500 μL结合缓冲液制成单细胞悬液,分别加入5 μL的Annexin V-FITC和PI溶液室温下孵育10 min。于1 h内应用流式细胞仪检测,通过CELL Quest软件分析细胞凋亡率。

1.2.7 PTENKi-67caspase-3 mRNA表达检测

收集各组MCF-7细胞,采用RT-qPCR检测PTENKi-67caspase-3 mRNA表达,方法同1.2.2。其中,PTEN正向5’-AGACGGAGAGGATGAATGTGC-3’,反向5’-AACCGCGATTCCTCAATGCT-3’,产物长度344 bp;Ki-67正向5’-ACCGTAGGTACAGTT-3’,反向5’-GTCAAGCAGAGCATT-3’,产物长度139 bp;caspase-3正向5’-TGCAATATGCAGATAC-3’,反向5’-CCGATAAGTACGATTAG-3’,产物长度266 bp;β-actin正向5’-TGACCACGATACGAGC-3’,反向5’-CGACGAGGATACGATCG-3’,产物长度145 bp。引物均由宝生物工程(大连)有限公司设计合成。

1.2.8 PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达检测

收集各组细胞,加入RIPA细胞裂解液裂解提取细胞总蛋白,通过BCA法进行蛋白定量。100 ℃沸水浴10 min。将蛋白样品按照30 μg/孔上样,电泳分离并转膜到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,5%脱脂牛奶室温封闭1 h,加入PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3、β-actin一抗(1∶1 000)4 ℃培养过夜。次日加入相应二抗(1∶5 000)室温孵育2 h。滴加化学发光试剂(ECL),显影曝光,JP-2880凝胶成像系统成像,以β-actin为内参,应用Image J软件对蛋白条带进行定量分析。

1.2.9 circRNA TCF25与miR-128b的靶向关系分析

通过TargetScan数据库(https://www.targetscan.org/vert_80/)预测circRNA TCF25的靶基因。采用脂质体转染法将WT circRNA TCF25、MUT circRNA TCF25荧光素酶报告载体分别与miR-128b模拟物、miR-NC共转染至人乳腺癌MCF-7细胞。常规培养48 h后,按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书检测miR-128b mimics组和miR-NC组细胞中circRNA TCF25荧光素酶相对活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析,符合正态分布的计量资料采用x±s表示,2组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组细胞circRNA TCF25、miR-128b表达比较

与空白组和si-NC组比,si-circRNA TCF25组细胞circRNA TCF25表达降低,miR-128b表达升高;pcDNA-circRNA TCF25组细胞circRNA TCF25表达升高,miR-128b表达降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。与空白组和miR-NC组比,miR-128b mimic组细胞circRNA TCF25表达降低,miR-128b表达升高;miR-128b inhibitor组细胞circRNA TCF25表达升高,miR-128b表达降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。与pcDNA-circRNA TCF25组比较,pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞circRNA TCF25表达降低,miR-128b表达升高,差异均有统计学意义(均P < 0.05),见表 1

表 1 各组细胞circRNA TCF25、miR-128b表达比较(x±s Tab.1 Comparison of circRNA TCF25 and miR-128b expression in each group (x±s)
Group n circRNA TCF25 miR-128b
Blank group 6 1.02±0.20 1.00±0.19
si-NC group 6 0.99±0.19 1.01±0.18
si-circRNA TCF25 group 6 0.52±0.091),2) 1.35±0.241),2)
pcDNA-circRNA TCF25 group 6 1.74±0.311),2) 0.71±0.121),2)
miR-NC group 6 1.00±0.18 0.98±0.17
miR-128b mimic group 6 0.66±0.121),3) 1.93±0.371),3)
miR-128b inhibitor group 6 1.42±0.261),3) 0.45±0.081),3)
pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group 6 1.22±0.204) 1.17±0.184)
1)P<0.05 vs. blank group;2)P<0.05 vs. si-NC group;3)P<0.05 vs. miR-NC group;4)P<0.05 vs. pcDNA-circRNA TCF25 group.

2.2 circRNA TCF25的鉴定及其亚细胞定位

与对照组比较,Rnase R组circRNA TCF25相对表达量无统计学差异(P > 0.05),而TCF25 mRNA相对表达量下降(P < 0.05),见表 2。核质分离实验显示,人乳腺癌MCF-7细胞中circRNA TCF25在胞质中的相对表达量(1.65±0.28)高于其在细胞核中的相对表达量(0.61±0.10,P < 0.05)。

表 2 circRNA TCF25与TCF25 mRNA表达比较(x±s Tab.2 Comparison of circRNA TCF25 and TCF25 mRNA expression (x±s)
Group n circRNA TCF25 TCF25 mRNA
Control 6 1.04±0.20 0.98±0.19
RNase R 6 0.96±0.18 0.22±0.031)
1)P<0.05 vs. control group.

2.3 各组细胞增殖活力比较

在24 h、48 h、72 h 3个时间点,与空白组和si-NC组比较,si-circRNA TCF25组细胞增殖活力降低,pcDNA-circRNA TCF25组细胞增殖活力升高,差异均有统计学意义(均P < 0.05);与空白组和miR-NC组比较,miR-128b mimic组细胞增殖活力降低,miR-128b inhibitor组细胞增殖活力升高,差异均有统计学意义(均P < 0.05);与pcDNA-circRNA TCF25组比较,pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞增殖活力降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05),见图 1

*P < 0.05 vs. blank group; #P < 0.05 vs. si-NC group; & P < 0.05 vs. miR-NC group; △P < 0.05 vs. pcDNA-circRNA TCF25 group. 图 1 各组细胞增殖活力比较 Fig.1 Comparison of cell proliferation activity in each group

2.4 各组细胞凋亡情况比较

空白组、si-NC组、si-circRNA TCF25组、pcDNA-circRNA TCF25组、miR-NC组、miR-128b mimic组、miR-128b inhibitor组、pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞凋亡率分别为(17.38±2.16)%、(15.22±2.67)%、(43.75±7.98)%、(8.64±1.19)%、(16.16±2.51)%、(38.84±7.43)%、(9.19±1.46)%和(14.45±2.19)%。与空白组和si-NC组比较,si-circRNA TCF25组细胞凋亡率升高,pcDNA-circRNA TCF25组细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05);与空白组和miR-NC组比较,miR-128b mimic组细胞凋亡率升高,miR-128b inhibitor组细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05);与pcDNA-circRNA TCF25组比较,pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞凋亡率升高,差异均有统计学意义(均P < 0.05),见图 2

图 2 流式细胞术检测各组细胞凋亡率 Fig.2 Cell apoptosis rates in each group determined using flow cytometry

2.5 各组细胞PTENKi-67caspase-3 mRNA表达比较

与空白组和si-NC组比较,si-circRNA TCF25组细胞Ki-67 mRNA表达降低,PTENcaspase-3 mRNA表达升高,pcDNA-circRNA TCF25组细胞Ki-67 mRNA表达升高,PTENcaspase-3 mRNA表达降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05);与空白组和miR-NC组比较,miR-128b mimic组细胞Ki-67 mRNA表达降低,PTENcaspase-3 mRNA表达升高,miR-128b inhibitor组细胞Ki-67 mRNA表达升高,PTENcaspase-3 mRNA表达降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05);与pcDNA-circRNA TCF25组比较,pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞Ki-67 mRNA表达降低,PTENcaspase-3 mRNA表达升高,差异均有统计学意义(均P < 0.05),见表 3

表 3 各组细胞PTENKi-67caspase-3 mRNA表达比较(x±s Tab.3 Comparison of PTEN, Ki-67, and caspase-3 mRNA expression in each group (x±s)
Group n PTEN mRNA Ki-67 mRNA Caspase-3 mRNA
Blank group 6 0.99±0.18 1.02±0.20 0.97±0.17
si-NC group 6 1.00±0.19 0.98±0.19 0.98±0.18
si-circRNA TCF25 group 6 1.37±0.221),2) 0.59±0.101),2) 1.52±0.281),2)
pcDNA-circRNA TCF25 group 6 0.62±0.111),2) 1.45±0.241),2) 0.73±0.131),2)
miR-NC group 6 0.97±0.16 1.00±0.19 1.03±0.20
miR-128b mimic group 6 1.41±0.261),3) 0.67±0.111),3) 1.49±0.271),3)
miR-128b inhibitor group 6 0.75±0.131),3) 1.64±0.301),3) 0.54±0.091),3)
pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group 6 0.89±0.154) 1.14±0.224) 0.95±0.174)
1)P<0.05 vs. blank group;2)P<0.05 vs. si-NC group;3)P<0.05 vs. miR-NC group;4)P<0.05 vs. pcDNA-circRNA TCF25 group.

2.6 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达比较

与空白组和si-NC组比较,si-circRNA TCF25组细胞Ki-67蛋白表达降低,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达升高;pcDNA-circRNA TCF25组细胞Ki-67蛋白表达升高,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。与空白组和miR-NC组比较,miR-128b mimic组细胞Ki-67蛋白表达降低,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达升高;miR-128b inhibitor组细胞Ki-67蛋白表达升高,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达降低,差异均有统计学意义(均P < 0.05)。与pcDNA-circRNA TCF25组比较,pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞Ki-67蛋白表达降低,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达升高,差异均有统计学意义(均P < 0.05),见表 4图 3

表 4 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达比较(x±s Tab.4 Comparison of PTEN, Ki-67, caspase-3, and cleaved caspase-3 protein expression in each group (x±s)
Group n PTEN Ki-67 caspase-3 cleaved caspase-3
Blank group 6 0.55±0.10 0.83±0.15 0.62±0.11 0.20±0.03
si-NC group 6 0.52±0.09 0.80±0.14 0.58±0.10 0.21±0.04
si-circRNA TCF25 group 6 0.78±0.131),2) 0.62±0.111),2) 0.83±0.151),2) 0.54±0.091),2)
pcDNA-circRNA TCF25 group 6 0.42±0.071),2) 1.09±0.191),2) 0.45±0.081),2) 0.11±0.021),2)
miR-NC group 6 0.49±0.08 0.85±0.16 0.63±0.12 0.23±0.04
miR-128b mimic group 6 0.66±0.121),3) 0.57±0.101),3) 0.94±0.161),3) 0.60±0.111),3)
miR-128b inhibitor group 6 0.37±0.061),3) 1.14±0.211),3) 0.40±0.071),3) 0.09±0.011),3)
pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group 6 0.59±0.104) 0.77±0.134) 0.68±0.124) 0.24±0.044)
1)P<0.05 vs. blank group;2)P<0.05 vs. si-NC group;3)P<0.05 vs. miR-NC group;4)P<0.05 vs. pcDNA-circRNA TCF25 group.

1, blank group; 2, si-NC group; 3, si-circRNA TCF25 group; 4, pcDNA-circRNA TCF25 group; 5, miR-NC group; 6, miR-128b mimic group; 7, miR-128b inhibitor group; 8, pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic group. 图 3 各组细胞PTEN、Ki-67、caspase-3、活化的caspase-3蛋白表达 Fig.3 PTEN, Ki-67, caspase-3, and cleaved caspase-3 protein expression in each group

2.7 circRNA TCF25与miR-128b的靶向关系分析

TargetScan数据库分析发现,miR-128b与circRNATCF25存在结合位点,提示miR-128b可能是circRNA TCF25的靶基因,见图 4。在转染WT circRNA TCF25细胞中,miR-128b mimic组细胞相对荧光强度低于miR-NC组细胞,差异有统计学意义(P < 0.05);在转染MUT circRNA TCF25细胞中,miR-128b mimic组和miR-NC组细胞相对荧光强度差异无统计学意义(P > 0.05),见图 4

*P < 0.05 vs. miR-NC group. 图 4 circRNA TCF25与miR-128b结合位点及各细胞相对荧光强度 Fig.4 CircRNA TCF25 and miR-128b binding sites and relative fluorescence intensity in cells

3 讨论

目前乳腺癌的发病机制尚不清楚。普遍认为乳腺癌的发生是体内外多种因素(包括遗传、高龄、肥胖、高脂肪饮食、月经初潮早、首次妊娠晚、抽烟酗酒等)共同作用的结果[7]。临床上治疗乳腺癌以手术治疗为主,辅以放化疗、内分泌治疗等综合治疗策略,但患者存在不良反应多、复发转移率高等问题。近年来,分子靶向药物的出现为乳腺癌的临床治疗提供了新思路,因此探究乳腺癌新的分子靶点对乳腺癌治疗意义重大。

circRNA是近年来发现的,它广泛存在于真核细胞内,结构较为稳定,基因序列高度保守[8]。众多研究[9-11]发现,circRNA可通过竞争性结合miRNA来解除miRNA对靶基因表达的抑制作用,在人类多种疾病的发生发展过程中发挥作用。王敏等[12]研究显示,circRNA TCF25可通过靶向抑制miR-103a-3p/miR-107表达,促进细胞分裂蛋白激酶6(CDK6)的表达,进而在膀胱癌的增殖和迁移中发挥促进作用。LI等[13]发现,过表达circRNA TCF25可通过降低miR-206的水平促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。本研究结果显示,与未经RNase R酶处理的对照组相比,circRNA TCF25的相对表达量在RNase R酶处理后无明显变化,而线性TCF25的相对表达量在经RNase R酶处理后降低,且circRNA TCF25在胞质中的相对表达量高于细胞核,验证了circRNA TCF25的环状特性,且证实了其主要定位于胞质。miR-128被认为是一种具有抑癌和促癌双面功能的miRNA,通常情况下发挥抑癌基因的作用,同时具有调节细胞增殖、凋亡和耐药等作用[14]。LIU等[15]指出,长链非编码RNA浆细胞瘤变异易位1(PVT1)可通过靶向抑制miR-128的表达诱导乳腺癌细胞的上皮-间质转化、增殖和转移,参与乳腺癌的进展。本研究中,与空白组和si-NC组比较,si-circRNA TCF25组细胞增殖活力降低,凋亡率升高;pcDNA-circRNA TCF25组细胞增殖活力升高,凋亡率降低。与空白组和miR-NC组比较,miR-128b mimic组细胞增殖活力降低,凋亡率升高;miR-128b inhibitor组细胞增殖活力升高,凋亡率降低。与pcDNA-circRNA TCF25组比较,pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞增殖活力降低,凋亡率升高,提示circRNA TCF25可促进人乳腺癌细胞MCF-7增殖,抑制其凋亡;而miR-128b能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7增殖,促进其凋亡。而且上调miR-128b表达能够逆转过表达circRNA TCF25对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡的影响,与以往研究结果一致。

本研究还发现,与空白组和si-NC组比较,si-circ-RNA TCF25组细胞Ki-67表达降低,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达升高;pcDNA-circRNA TCF25组细胞Ki-67表达升高,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达降低。与空白组和miR-NC组比较,miR-128b mimic组细胞Ki-67表达降低,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达升高;miR-128b inhibitor组细胞Ki-67表达升高,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达降低。与pcDNA-circRNA TCF25组比较,pcDNA-circRNA TCF25+miR-128b mimic组细胞Ki-67表达降低,PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达升高,提示circRNA TCF25有促进Ki-67的表达,抑制PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达的作用,而miR-128b的作用与circ-RNA TCF25相反,且上调miR-128b表达能够逆转过表达circRNA TCF25对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡相关基因蛋白表达的影响。PTEN是一种具有特异性磷酸酯酶活性的抑癌基因,具有抑制肿瘤细胞生长增殖、诱导细胞周期阻滞和促进细胞凋亡等多种功能。相关研究[16]显示,PTEN在多种肿瘤细胞中表达水平降低。caspase-3是细胞凋亡中的最后执行因子,当细胞受到凋亡信号刺激时caspase-3活化,活化的caspase-3通过酶切割特异性底物、DNA修复相关分子及细胞骨架蛋白等促进细胞凋亡[17]。Ki-67是一种核蛋白,表达于细胞生长发育的各个周期,能反映组织细胞的增殖活性[18]。马兆霞[19]指出,miR-128可通过激活PTEN信号通路参与调控子宫内膜癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等细胞生物学行为;MA等[20]研究显示,miR-128b可通过促进caspase-3表达促进大脑中动脉闭塞大鼠脑组织细胞凋亡。LIANG等[21]发现,miR-128可通过下调Ki-67在胃癌细胞中的表达抑制胃癌细胞的生长,提高化疗敏感性。双荧光素酶实验结果证实了circRNA TCF25可靶向调控miR-128b,因此合理推测circRNA TCF25可能是通过靶向抑制miR-128b的表达,调控其下游的细胞增殖、凋亡相关基因表达来发挥促进人乳腺癌细胞MCF-7增殖,抑制其凋亡作用的。

综上所述,circRNA TCF25可能是通过靶向抑制miR-128b表达,促进Ki-67表达,抑制PTEN、caspase-3、活化的caspase-3表达,发挥促进人乳腺癌细胞MCF-7增殖,抑制其凋亡作用的。本研究初步阐释了circ-RNA TCF25对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、凋亡的影响及可能作用机制,为乳腺癌的临床治疗提供了潜在靶点。

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