2024, Vol. 53文章信息
- 关冀弛, 杨金雨, 刘丹, 李磊, 李东华, 汪海峰
- GUAN Jichi, YANG Jinyu, LIU Dan, LI Lei, LI Donghua, WANG Haifeng
- 丙泊酚作用NLRP3/ASC/caspase-1通路对肺癌A549细胞焦亡的影响
- Effect of propofol on pyroptosis of lung cancer A549 cells by NLRP3/ASC/caspase-1 pathway
- 中国医科大学学报, 2024, 53(2): 132-135, 141
- Journal of China Medical University, 2024, 53(2): 132-135, 141
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文章历史
- 收稿日期：2023-03-02
- 网络出版时间：2024-01-10 16:29:01
引用本文 |
原发性肺癌是最常见的恶性肿瘤，在全球大部分国家中其发病率、死亡率最高。寻找高效低毒性的化疗药物或方案对治疗肺癌有重要意义 [1-3]。丙泊酚是一种烷基酸类的短效静脉麻醉药，研究发现丙泊酚在肺癌[4]和结直肠癌[5]等的发生与转移中起抑制作用，可以影响肿瘤细胞的增殖、分化等途径。细胞焦亡是一种细胞程序性死亡方式，通过激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）家族的部分蛋白，使其切割并激活焦孔素蛋白（gasdermin，GSDM），活化的GSDM转移到细胞膜上形成孔洞，胞质外流，胞内炎性细胞因子释放，最终导致细胞膜破裂、细胞死亡[6-7]。NLRP3/ASC/caspase-1通路构成了炎症小体激活的经典通路，在多种危险信号刺激下被激活。三维培养的肿瘤细胞可以获得持续自我复制、肿瘤血管生成等生物学特性，在肿瘤疾病的治疗和耐药机制等方面具有广泛的应用前景[8]。本研究以超低吸附培养法建立肺癌A549细胞三维培养模型，研究丙泊酚通过激活NLRP3/ASC/caspase-1通路促进细胞焦亡而抑制肺癌A549细胞增殖的作用机制，为肺癌疾病的研究和治疗提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞株人肺癌A549细胞株，购自中国科学院细胞库。
1.2 主要药物、试剂与仪器RPMI1640培养基（美国Gibco公司），TBD优级胎牛血清（中国苏州瑞诺德生物科技有限公司），HyClone双抗（中国上海华雅思创生物科技有限公司），胰蛋白酶（美国Gibco公司），ULA 24、96孔板（美国Corning公司），CCK-8、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-18、酶联免疫吸附试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、兔抗人NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、GAPDH一抗及二抗均购自中国上海碧云天生物技术有限公司。低速台式离心机（中国上海安亭科学仪器厂），酶标仪（中国深圳雷杜生命科学股份有限公司），超净工作台（中国苏州安泰空气技术有限公司），二氧化碳培养箱（日本三洋公司），倒置显微镜（中国沈阳禾光科技有限公司）。
1.3 三维细胞培养倒置显微镜下观察A549细胞生长至细胞培养瓶底约90 %时，加入PBS溶液清洗，胰蛋白酶消化，离心，血球计数板计数，制成浓度为1×105/mL细胞悬液，3D细胞培养基质胶50 μL/孔加入96孔板，置于37 ℃烘箱过夜烘干，即可得到ULA96孔板，而后100 μL/孔加入ULA 96孔板中，放置于37 ℃、5 % 培养箱中培养，隔天换液。
1.4 药物处理空白对照组肺癌A549细胞在RPMI 1640培养基中培养；根据丙泊酚浓度分为低浓度组（20 μmol/L）、中浓度组（60 μmol/L）和高浓度组（100 μmol/L），分别处理细胞[9]，每组设置6个平行样品。
1.5 CCK-8法检测细胞增殖A549细胞于ULA 96孔板培养48 h后，小心吸除各孔培养基，每孔加入20 μL药物，空白组加入同等体积的培养基。继续培养24、48、72 h，小心吸出孔内液体，每孔加入20 μL CCK-8溶液作用2 h，酶标仪520 nm记录吸光度值，计算细胞存活率。
1.6 ELISA检测细胞上清炎性细胞因子将A549细胞以每孔5×105/mL接种于ULA 24孔板，培养24 h后，按照1.4中方法分组处理细胞，培养48 h，12 000 r/min离心30 min，收集上清，ELISA试剂盒检测上清IL-18、IL-1β、IL-6水平。
1.7 蛋白免疫印迹法检测细胞焦亡蛋白表达水平按照1.4中方法分组处理细胞，48 h后弃培养液，将细胞收集于EP管内离心3 min，预冷PBS清洗细胞3次，加入含蛋白酶抑制剂RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r/min离心10 min，收集上清即为细胞总蛋白，BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白总浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯膜后，脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗人NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β、GAPDH一抗（1∶2 000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜，PBST洗涤30 min后加入相应二抗（1∶4 000稀释）孵育2 h，配制ECL显影液，以GAPDH为内参，分析目的蛋白表达水平。
1.8 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计分析，符合正态分布的数据以x±s表示，组间比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 A549细胞三维生物学行为三维培养A549细胞于光学显微镜下呈悬浮聚集式生长，细胞间有聚拢黏附趋势，在培养12 h即可清晰观察到细胞成球，且细胞球形状、大小不一。随着培养时间的增长，细胞球体积逐渐增大，且逐渐圆滑。见图 1。
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| A, 12 h; B, 24 h; C, 48 h; D, 72 h. 图 1 不同培养时间段A549细胞形态 ×200 Fig.1 Morphology of A549 cells in different culture periodsS ×200 |
2.2 丙泊酚对A549细胞增殖的影响
与空白对照组相比，低、中、高浓度丙泊酚组A549细胞存活率随着处理时间和丙泊酚剂量的增加逐渐降低（P < 0.05）。见表 1。
| Group | Cell viability | ||
| 24 h | 48 h | 72 h | |
| Control | 100.0±0.0 | 100.0±0.0 | 100.0±0.0 |
| Low concentration | 95.6±13.51） | 89.1±11.71） | 76.8±14.31） |
| Medium concentration | 72.8±10.41），2） | 61.3±10.31），2） | 49.7±12.21），2） |
| High concentration | 58.3±11.81），2），3） | 45.7±12.71），2），3） | 25.9±13.51），2），3） |
| 1）compared with control group，P < 0.05；2）compared with low concentration group，P < 0.05；3）compared with medium concentration group，P < 0.05. | |||
2.3 丙泊酚对A549细胞上清炎性细胞因子的影响
与空白对照组相比，低、中、高浓度丙泊酚组A549细胞上清炎性细胞因子IL-18、IL-1β、IL-6水平随着药物剂量的增加而增加（P < 0.05）。见表 2。
| Group | IL-18（ng/L） | IL-1β（μg/L） | IL-6（pg/mL） |
| Control | 64.28±6.33 | 1.06±0.59 | 110.36±11.25 |
| Low concentration | 118.49±11.751） | 2.36±0.751） | 135.48±16.531） |
| Medium concentration | 159.64±20.181），2） | 3.14±0.841），2） | 187.64±20.361），2） |
| High concentration | 276.38±35.571），2），3） | 4.36±0.911），2），3） | 228.41±29.671），2），3） |
| 1）compared with control group，P < 0.05；2）compared with low concentration group，P < 0.05；3）compared with medium concentration group，P < 0.05. | |||
2.4 丙泊酚对A549细胞NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达的影响
与空白对照组相比，低、中、高浓度丙泊酚组A549细胞NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达水平依次增加（P < 0.05）。见图 2、表 3。
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| 1, control group; 2, low concentration group; 3, medium concentration group; 4;high concentration group. 图 2 各组A549细胞NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达 Fig.2 Expression of NLRP3, ASC, caspase-1, GSDMD-N, and IL-1β in A549 cells of each group |
| Group | NLRP3 | ASC | Caspase-1 | GSDMD-N | IL-1β |
| Control | 0.63±0.04 | 1.12±0.11 | 0.87±0.09 | 1.36±0.19 | 1.42±0.21 |
| Low concentration | 1.24±0.121） | 1.51±0.191） | 1.34±0.131） | 1.93±0.251） | 2.01±0.291） |
| Medium concentration | 1.67±0.151），2） | 2.15±0.251），2） | 1.96±0.191），2） | 2.64±0.311），2） | 2.98±0.371），2） |
| High concentration | 2.01±0.191），2），3） | 2.97±0.291），2），3） | 2.61±0.241），2），3） | 3.28±0.451），2），3） | 3.57±0.491），2），3） |
| 1）compared with control group，P < 0.05；2）compared with low concentration group，P < 0.05；3）compared with medium concentration group，P < 0.05. | |||||
3 讨论
肺癌作为最常见的恶性肿瘤，其发病率、死亡率高，选择合适的化疗药物及治疗手段有助于肺癌疾病的治疗和预后，肿瘤细胞与微环境的相互作用直接影响肿瘤的生长、转移、侵袭和复发，肿瘤细胞间及与细胞质基质间的相互作用将产生肿瘤黏附耐药，导致肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低，影响化疗药物的疗效[10]。
超低吸附培养法为肿瘤细胞三维培养方法，细胞培养板孔底附着与表面共价键结合的水凝胶，能最大限度地减少肿瘤细胞附着、细胞活化、蛋白质吸收和酶活化，使肿瘤细胞以三维模型成球生长 [11]。TOFANI等[12]采用ULA法培养卵巢癌细胞并使用紫杉醇进行药物反应分析，结果表明卵巢癌细胞以球形发育，球体表面存在微绒毛，凋亡细胞更高，耐药性也更高。
丙泊酚一直以麻醉剂形式广泛应用于手术麻醉过程。丙泊酚在作为非麻醉剂应用时，是癌症进展的新兴调节剂，可调控肿瘤细胞增殖、凋亡、焦亡、转移与侵袭等信号通路，广泛应用于人类多种癌症研究[13]。本研究结果显示，不同浓度丙泊酚处理后，A549细胞存活率随着丙泊酚浓度的增加而依次降低，证明丙泊酚可抑制肺癌A549细胞增殖。
细胞焦亡是一种新型细胞程序性死亡方式，在病毒、细菌、炎症等病理刺激下，NLRP3炎症小体形成，进而激活caspase-1。活化的caspase-1作用于GSDMD-N端，在细胞膜上形成孔洞，细胞肿胀破裂，细胞内容物释放，细胞焦亡会释放炎性细胞因子，激发人体免疫系统进而产生抗炎作用，细胞焦亡发生在肿瘤细胞中时，IL-18、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子在肿瘤细胞中起抑制作用[6]。
NLRP3/ASC/caspase-1通路是细胞焦亡经典通路，NLRP3炎症小体的形成促进caspase-1激活，caspase-1活化水解后产生IL-18、IL-1β等炎性细胞因子，同时caspase-1激活GSDMD，使其转移到细胞膜上形成孔洞，将IL-1β、IL-18等炎性细胞因子释放到胞外，IL-18、IL-1β等炎性细胞因子又可以作用于肿瘤细胞发挥抗癌作用[14]。本研究中，丙泊酚作用于肺癌A549细胞后，蛋白免疫印迹检测细胞焦亡蛋白表达，结果显示，丙泊酚激发了肿瘤细胞的细胞焦亡过程，促进了细胞焦亡相关蛋白表达；通过酶联免疫吸附法测定上清炎性细胞因子，结果显示，细胞焦亡会促进炎性细胞因子的释放，证明了肺癌A549细胞焦亡的发生，且肿瘤细胞生长受到抑制。
综上所述，本研究通过超低吸附培养法成功建立肺癌A549三维培养模型，丙泊酚可能通过激活NLRP3/ASC/caspase-1细胞焦亡通路促进肺癌A549细胞焦亡，从而抑制A549细胞增殖。本研究重点研究三维培养肺癌A549细胞的细胞焦亡过程，为肺癌的治疗和研究提供了一定的依据。
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