类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是常见的慢性自身免疫性炎症疾病，其特征表现为持续性滑膜炎和关节破坏^[1]。RA基本病变是大量炎性细胞因子产生和滑膜增生，Treg/Th17细胞失衡影响炎性细胞因子水平，进而导致RA进展^[2-3]。研究^[4-5]显示，Th17细胞通过分泌白细胞介素（interleukin，IL）-17促进炎症反应加速RA进展，而Treg细胞通过分泌IL-10发挥抗炎作用抑制RA进展。因此，调节Treg和Th17细胞平衡可能抑制RA发展。芹菜素（apigenin，API）是植物中最丰富的黄酮类化合物之一，具有抗氧化、抗癌和抗炎等作用^[6]。已有研究^[7]表明，API可通过抑制滑膜增生、血管生成、骨细胞生成在RA中发挥保护作用。此外，还有研究^[8]发现API处理的树突状细胞共培养的T细胞中Th17细胞比例降低，Treg细胞比例增加。目前，API能否通过调节Treg/Th17细胞平衡来改善RA症状及其作用机制尚不清楚。本研究探讨API对胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠关节炎的影响及其对Treg/Th17细胞平衡的调节作用，并进一步分析可能的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物、主要试剂和仪器

Wistar大鼠（6周龄，体重140~180 g，雄性，共50只）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。HEK-293T细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。胎牛血清和DMEM高糖培养基购自美国Gibco公司，慢病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司，Lipofectamine 3000转染试剂、细胞培养箱和流式细胞仪购自美国Thermo公司，双萤光素酶报告基因检测试剂盒和化学发光仪购自美国Promega公司，Western blotting相关试剂购自上海碧云天生物技术股份有限公司，实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）相关试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，SOCS3和GAPDH抗体购自美国abcam公司，CD4、CD25、IL-17和Foxp3抗体购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，HE染色试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司，酶标仪购自美国BioTek公司，凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 CIA大鼠模型建立

取乳化剂（0.2 mL牛Ⅱ型胶原和弗氏完全佐剂乳剂等比例混合乳化）经大鼠尾部注射进行首次免疫。首次免疫后7 d取乳化剂（0.4 mL牛Ⅱ型胶原和弗氏不完全佐剂乳剂等比例混合乳化）经大鼠尾部注射进行加强免疫^[3]。通过观察大鼠足部肿胀程度、检测关节炎指数评分以及HE染色观察踝关节组织病理损伤来评价模型是否建立成功。

1.2.2 动物分组及处理

将50只Wistar大鼠随机分为对照组（Control组）、模型组（CIA组）、API组、API+敲减对照组（API+sh-NC组）和API+敲减SOCS3组（API+sh-SOCS3组），每组10只。CIA组、API组、API+sh-NC组和API+sh-SOCS3组大鼠按1.2.1方法制备CIA模型。对照组大鼠于相同时间注射乳化剂等量的生理盐水。API组、API+sh-NC组和API+sh-SOCS3组大鼠于第1次注射乳化剂前1 d开始腹腔注射API（20 mg/kg），持续50 d。API+sh-NC组和API+sh-SOCS3组于第10天和第30天经尾静脉注射敲减对照和敲减SOCS3慢病毒（50 μL，滴度为1×10⁸ TU/mL）。各组大鼠于最后1次给予API后第2天脱颈椎法处死，取血清、脾脏、踝关节和滑膜组织用于后续实验。

1.2.3 关节炎指数评分

各组大鼠于造模后第7天至第50天进行关节炎指数评分^[9]。评分标准：0分，正常；1分，跗关节或脚踝出现红肿；2分，红肿和轻度肿胀从脚踝蔓延到跗关节；3分，发红和中度肿胀从脚踝蔓延到跖骨关节；4分，遍及整个足部的严重肿胀和四肢僵硬。

1.2.4 HE染色

按HE染色试剂盒说明书对大鼠踝关节组织进行染色。多聚甲醛固定的踝关节组织用EDTA脱钙后，经脱水、透明、浸蜡和包埋后切成厚4 μm的石蜡切片。石蜡切片烘干后二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，然后依次进行苏木素染色、盐酸酒精分化和伊红染色，染色后切片经梯度乙醇脱水和二甲苯透明后，中性树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。

1.2.5 酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

严格按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清中IL-17A、IL-6、TGF-β和IL-10水平。

1.2.6 流式细胞术

取大鼠脾脏，无菌PBS匀浆，用200目细胞过滤器过滤细胞悬液，300 g离心并弃上清，红细胞溶解液重悬细胞。取1×10⁶个脾细胞，用PE偶联的抗CD4抗体和ER780偶联的抗CD25抗体4 ℃染色45 min。PBS洗涤后，细胞内固定和渗透缓冲液用于固定和渗透脾细胞。PBS洗涤脾细胞，并与APC偶联的抗IL-17抗体和FITC偶联的抗Foxp3抗体4 ℃染色45 min。PBS洗涤后流式细胞仪中检测Treg/Th17细胞。

1.2.7 RT-qPCR

大鼠滑膜组织液氮冷冻后经研钵研碎，用Trizol试剂收集研磨后的滑膜组织并提取组织中总RNA。将提取的RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行RT-qPCR反应，以U6和GAPDH为内参，采用2^-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.2.8 Western blotting

大鼠滑膜组织液氮冷冻后经研钵研碎，用RIPA裂解液收集研磨后的滑膜组织并提取组织总蛋白，BCA法进行蛋白定量。取20 μg蛋白样本煮样使其充分变性后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，SOCS3（1∶1 000稀释）和GAPDH（1∶5 000稀释）抗体4 ℃孵育过夜。PBST洗膜3次，二抗室温孵育1 h，PBST洗膜3次，ECL化学发光，使用ImageJ软件进行灰度分析。

1.2.9 双萤光素酶报告基因实验

取对数生长期的HEK-293T细胞均匀铺板于24孔板中，培养过夜后，将细胞分为SOCS3-WT和mimics NC共转染组、SOCS3-WT和miR-181a-5p mimics共转染组、SOCS3-MUT和mimics NC共转染组和SOCS3-MUT和miR-181a-5p mimics共转染组，各组细胞严格按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行转染，转染后细胞继续培养24 h后弃培养基，PBS洗去残余培养基，加入裂解液后室温摇晃15 min，并通过相应试剂盒检测细胞的萤光素酶活性。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，并采用Tukey事后检验进行组间两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 API对CIA大鼠关节炎症状的影响

Control组大鼠关节炎指数为0，且随着时间的推移无改变，足部未发现水肿；CIA组大鼠关节炎指数随时间的推移迅速增加，并于第44天达到峰值，足部水肿严重；API组大鼠关节炎指数于第44天开始明显低于CIA组（P < 0.05），足部的水肿程度与CIA组比较明显降低。见图 1。

2.2 API对CIA大鼠踝关节滑膜损伤的影响

对照组大鼠未见关节滑膜损伤。CIA组大鼠关节腔可见大量炎症细胞浸润及增生的滑膜组织。与CIA组比较，API组大鼠关节滑膜损伤改善。见图 2。

2.3 API对CIA大鼠Treg/Th17细胞平衡的影响

与Control组比较，CIA组大鼠血清中IL-17A和IL-6水平以及脾细胞中CD4⁺ IL17A⁺细胞数均明显升高，血清中TGF-β和IL-10水平以及脾细胞中CD25⁺ Foxp³⁺细胞数均明显降低（P < 0.05）。与CIA组比较，API组大鼠血清中IL-17A和IL-6水平以及脾细胞中CD4⁺ IL17A⁺细胞数明显降低，血清中TGF-β和IL-10水平以及脾细胞中CD25⁺ Foxp³⁺细胞数明显升高（均P < 0.05）。见图 3。

2.4 API对CIA大鼠滑膜中miR-181a-5p和SOCS3表达的影响

与Control组比较，CIA组大鼠滑膜组织中miR-181a-5p表达水平明显升高，SOCS3 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P < 0.05）。与CIA组比较，API组大鼠滑膜组织中miR-181a-5p表达水平明显降低，SOCS3 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P < 0.05）。见图 4。

2.5 miR-181a-5p与SOCS3间的靶向关系

与mimics NC组比较，miR-181a-5p mimics组转染SOCS3-WT的HEK-293T细胞的萤光素酶活性明显降低（P < 0.05），而转染SOCS3-MUT的HEK-293T细胞的萤光素酶活性无明显差异（P > 0.05）。见图 5。

2.6 API介导SOCS3影响CIA大鼠关节炎症状和踝关节滑膜损伤

与API+sh-NC组比较，API+sh-SOCS3组大鼠滑膜组织中miR-181a-5p表达水平无统计学差异（P > 0.05），SOCS3 mRNA和蛋白表达水平明显降低（均P < 0.05）。API+sh-NC组大鼠关节炎指数随时间推移增加，并于第38天达到峰值，足部水肿程度和关节滑膜损伤较轻。API+sh-SOCS3组大鼠关节炎指数于第26天开始明显高于API+sh-NC组（P < 0.05），足部水肿和关节滑膜损伤程度重于API+sh-NC组。见图 6。

2.7 API介导SOCS3影响CIA大鼠Treg/Th17细胞平衡

与API+sh-NC组比较，API+sh-SOCS3组大鼠血清中IL-17A和IL-6水平以及脾细胞中CD4⁺ IL17A⁺细胞数明显升高，血清中TGF-β和IL-10水平以及脾细胞中CD25⁺ Foxp³⁺细胞数明显降低（P < 0.05）。见图 7。

3 讨论

API对RA的改善作用已有报道。LI等^[7]研究发现API抑制CIA小鼠滑膜增生，通过下调血管内皮细胞生长因子及其受体抑制CIA小鼠滑膜组织中的血管生成，并通过抑制RANKL/RANK/OPG信号通路抑制CIA小鼠滑膜组织中的破骨细胞生成。SUN等^[10]研究发现，API抑制LPS诱导的巨噬细胞释放IL-6和TNF-α，并抑制ConA诱导的脾T淋巴细胞释放IFN-γ和IL-2，表明API抑制RA中免疫细胞的炎症反应。本研究结果显示，API降低CIA大鼠的关节炎指数评分，改善CIA诱导的大鼠足部肿胀和滑膜病理损伤。此外，本研究结果显示，API降低CIA大鼠血清IL-17A和IL-6水平并增加TGF-β和IL-10水平，降低大鼠脾细胞中CD4⁺ IL17A⁺ Th17细胞比例并增加CD25⁺ Foxp³⁺ Treg细胞比例，表明API改善了CIA诱导的Treg/Th17细胞失衡状态。

最近，多项研究表明miRNA调节RA进展中Treg/Th17细胞平衡。JIN等^[11]研究发现，Maresin 1通过上调miR-21增加RA关节中Treg细胞比例并降低Th17细胞比例，改善Treg/Th17细胞失衡状态，减少关节炎症和损伤。XIE等^[12]研究发现NF-κB诱导miR-34a表达抑制其靶基因Foxp3表达，破坏Treg/Th17细胞平衡，从而促进CIA小鼠关节损伤。本研究结果显示，API下调CIA大鼠滑膜组织中miR-181a-5p表达。此外，本研究还鉴定了miR-181a-5p的下游靶基因SOCS3；并发现SOCS3 mRNA的3’-UTR存在miR-181a-5p的潜在结合位点，而且API上调CIA大鼠滑膜组织中SOCS3表达。说明API改善RA中的Treg/Th17细胞失衡状态可能是通过下调miR-181a-5p表达上调其下游靶基因SOCS3表达来实现的。

SOCS3在RA中的保护作用已广泛报道。研究^[13]表明SOCS3通过抑制信号转导和转录激活因子3/类视黄醇相关的孤儿核受体γt信号通路抑制Th17细胞分化。ZHAO等^[14]研究发现，艾灸可以通过调节SOCS3的表达水平来调节Treg/Th17细胞平衡，并减轻RA进展；且敲低SOCS3逆转了艾灸在缓解RA和调节Treg/Th17细胞平衡中的保护作用。AARTS等^[15]研究发现，过表达IL-22可增强SOCS3表达降低CIA发病率和关节严重程度。还有研究^[16]发现西洛他唑联合塞来昔布治疗通过激活IL-10和SOCS3协同作用来抑制RA患者滑膜成纤维细胞中促炎细胞因子的分泌。本研究结果显示，敲减SOCS3逆转了API对CIA大鼠滑膜损伤的改善作用，也逆转了API对CIA大鼠Treg/Th17细胞失衡的改善作用。

综上所述，API对RA诱导的关节损伤具有改善作用；其机制可能是通过下调miR-181a-5p表达上调其下游靶基因SOCS3表达，从而改善Treg/Th17细胞失衡状态来实现的。然而，本研究仅验证了敲减SOCS3部分逆转API对RA诱导的关节损伤的改善作用，API是否介导miR-181a-5p调节SOCS3表达发挥作用有待在后续实验中进一步验证。