结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种常见的大肠上皮来源胃肠道恶性肿瘤，饮食、肥胖、肠道微生物群、吸烟、环境、遗传等均为CRC的危险因素^[1]。近年来，我国CRC发病率不断增加，到2025年，估计我国CRC患者将达642 300例，其中死亡221 100例^[2]。早期CRC患者5年存活率较高，但多数患者就诊时已达中晚期，预后较差^[3]。因此，研究CRC进展及预后相关分子标志物对制定个体化治疗方案、开发潜在治疗靶点、改善预后尤为关键。硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein，TXNIP）是α阻滞蛋白家族成员，也是硫氧还蛋白活性的内源性抑制剂，参与氧化还原稳态、葡萄糖代谢。研究^[4]证明，TXNIP参与CRC发展，过表达TXNIP可抑制CRC细胞恶性行为。Krüppel样转录因子（Krüppel like transcription factor，KLF）9属于KLF转录因子家族，通过3个C2-H2锌指结构结合GC-box，调控神经元发育、细胞分化和生长、凋亡等过程。近年来的研究^[5-6]表明，KLF9在CRC、肾癌、胃癌等癌症中表达下调，并与癌症转移及预后有关。然而TXNIP、KLF9与CRC临床病理特征及预后的关系鲜有报道。本研究拟通过检测CRC组织中TXNIP、KLF9的表达，探讨TXNIP、KLF9与CRC发生、发展及预后的相关性。

1 材料与方法 1.1 一般资料

选择2017年1月至2020年12月于我院初次确诊并进行手术治疗的CRC患者90例，术中收集CRC组织及癌旁组织（距离癌组织 > 5 cm）。年龄40~72岁，平均（59.18±7.65）岁。男53例，女37例。纳入标准：行根治性切除术；初次确诊，无新辅助化疗、放疗等治疗史；无远端转移征象；石蜡病理标本保存完整；无其他部位肿瘤；患者及其家属知情同意。排除标准：发生远处转移；合并感染性疾病；其他器官严重疾病；随访资料不全；自身免疫缺陷症；近期外科手术史；CRC复发。本研究获得我院医学伦理委员会批准（k2020197），符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2 方法

1.2.1 检测TXNIP和KLF9表达

采用免疫组织化学试剂盒（货号：ml092486，上海酶联生物科技有限公司）检测癌组织中TXNIP和KLF9蛋白的表达情况。术中收集新鲜癌组织及癌旁组织，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作4 μm切片，脱蜡、水化、抗原修复；依次用ddH₂O、PBST浸泡、清洗，滴加50 μL灭活酶试剂，室温避光放置15 min，PBST浸泡洗涤，滴加3% BSA-PBST 50 μL封闭；滴加TXNIP一抗（稀释1∶200，货号abs136992，爱必信生物科技有限公司）、KLF9一抗（稀释1∶200，货号CSB-PA622687ESR2HU，武汉华美生物工程有限公司）孵育过夜；室温放置30 min，PBST洗涤；滴加生物素标记羊抗兔二抗（货号ab6721，英国abcam公司）孵育30 min，PBST冲洗；DAB显色，苏木素复染（货号G1080，北京索莱宝科技有限公司），脱色反蓝，封片，光学显微镜下观察。取5个高倍视野（×400）；由2位经验丰富的病理医师独立阅片，每个视野计数100个肿瘤细胞。染色结果判定^[7]：无着色、浅黄色、黄色、棕褐色分别计为0、1、2、3分。阳性染色细胞占比≤5%、> 5%~25%、> 25%~50%、> 50%~75%、> 75%分别计为0、1、2、3、4分；2种计分相乘，0~1分为阴性表达，2~7分为阳性表达。

1.2.2 随访

术后以门诊或电话形式随访CRC患者2年，截止时间为2023年1月或患者死亡。

1.2.3 基因表达水平值的交互式分析平台（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库检索

在GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/）中检索，设定基因为TXNIP、KLF9，癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据集设定为直肠腺癌（rectal adenocarcinoma，READ），分析TXNIP、KLF9表达。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0软件处理数据。计数资料用率（%）表示，采用χ²检验进行比较。采用Kaplan-Meier检验分析TXNIP、KLF9阳性表达与术后3年总生存率的关系，行log-rank检验。利用GEPIA数据库及Spearman法分析CRC组织TXNIP、KLF9表达的相关性。采用Cox回归分析CRC患者预后的影响因素。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 GEPIA数据库中TXNIP、KLF9表达水平比较

GEPIA数据库分析显示，与正常组织相比，TXNIP、KLF9 mRNA表达水平均在READ中明显降低（P < 0.01），见图 1。进一步分析TXNIP、KLF9不同表达水平与READ患者总生存率的关系，结果显示，不同TXNIP、KLF9表达水平的READ比较，总生存率的差异无统计学意义（P > 0.05），见图 2。

2.2 CRC癌组织TXNIP、KLF9蛋白表达比较

免疫组织化学结果显示，CRC癌组织中TXNIP阳性表达率（32.22%，29/90）、KLF9阳性表达率（37.78%，34/90）明显低于癌旁组织（73.33%，66/90；76.67%，69/90），差异有统计学意义（P < 0.05）。见图 3、表 1。

2.3 CRC组织中TXNIP、KLF9表达的相关性

Spearman分析发现，CRC组织中TXNIP与KLF9阳性表达率显著相关（r = 0.519，P < 0.05）；GEPIA数据库检索结果显示，TXNIP与KLF9表达呈正相关（P < 0.05）。见图 4。

2.4 CRC组织中TXNIP、KLF9蛋白表达与临床病理特征的关系

Cox回归分析结果显示，TNM分期为Ⅲ期、淋巴结发生转移的患者CRC组织中TXNIP、KLF9阳性表达率显著低于TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期、淋巴结无转移患者，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。

2.5 CRC组织中TXNIP、KLF9蛋白表达水平与总生存率的关系

截至随访结束，本研究90例CRC患者中，死亡23例，存活67例，总生存率为74.44%。生存分析显示，TXNIP阳性表达CRC患者总生存率（89.66%，26/29）高于阴性表达患者（67.21%，41/61），差异有统计学意义（χ²=5.240，P = 0.022）；KLF9阳性表达患者2年总生存率（88.24%，30/34）高于阴性表达患者（66.07%，37/56），差异有统计学意义（χ²=5.623，P = 0.018）。见图 5。

2.6 CRC预后的影响因素分析

以随访期间CRC患者死亡与否为因变量（死亡= 1，存活=0），单因素分析显示，TNM分期、TXNIP及KLF9蛋白表达与CRC患者预后显著相关（P < 0.05）。多因素Cox回归发现，TNM分期为Ⅲ期、TXNIP蛋白阴性表达、KLF9蛋白阴性表达是预后危险因素（P < 0.05）。见表 3。

3 讨论

据统计，我国CRC平均诊疗费用以每年6.9%~ 9.2%的速度增长，患者在新诊断后1年内的个人医疗费用约占其家庭收入的60%^[8]。CRC的有效预防手段为结直肠镜检查，有助于尽早明确癌前病变，阻止病情进展，但该方式为有创检查，技术要求较高，人群接受度低，检查时间长。CT和磁共振成像等影像学检查也存在放射性和成本高的缺点^[9]。Ⅰ期、Ⅳ期CRC患者的5年生存率分别为96.6%、34.3%^[3]。因此，寻找简单、无创、经济、患者接受度高的临床筛查方法，对提高CRC的检出率具有重要的临床意义。

CRC发病过程包含原癌基因激活、DNA甲基化、关键分子突变及分子异常表达等^[10]。TXNIP是一种多功能蛋白，其表达受转录调控、mRNA、微RNA、蛋白质降解等多种机制调控，可促进自噬，调节mRNA、lncRNA表达，对代谢活动、炎症反应、氧化还原稳态、细胞行为等至关重要，已证实TXNIP在CRC、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多种癌症中表达降低，且表达水平越低，癌症分期越高^[11]。YUAN等^[12]有关骨肉瘤的研究显示，TXNIP可通过上调DDIT4和抑制mTORC1下游底物S6的磷酸化，控制癌细胞迁移、侵袭，促进其凋亡。本研究发现，CRC组织中TXNIP蛋白阳性表达率较低，与上述研究相符，表明TXNIP在CRC组织中呈低表达。TXNIP是葡萄糖摄取的有效负调节剂，文献[13]报道，TXNIP可调节葡萄糖代谢并抑制CRC癌细胞中的葡萄糖摄取，NDRG2通过调节TXNIP作为CRC糖酵解的关键调节因子发挥作用；酮体可刺激TXNIP表达，减少葡萄糖摄取，促进细胞凋亡，抑制CRC细胞增殖，这表明提高TXNIP表达水平可能成为癌症的一种治疗选择^[14]。此外，TXNIP还参与CRC中的免疫炎症反应，抑制MondoA-TXNIP轴促进葡萄糖摄取和糖酵解，诱导高糖酵解Th17样Tregs，促进Th17炎症，促进白细胞介素-17a诱导的CD8+T细胞耗竭，促进CRC的发生^[15]。王莹琼等^[16]研究显示，非小细胞肺癌组织中TXNIP低表达与淋巴结转移、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期及低分化有关。本研究通过分析TXNIP与CRC临床特征的关系发现，TNMⅢ期、淋巴结发生转移的患者TXNIP阳性表达率较低，表明TXNIP阳性表达与CRC有显著相关性，可反映CRC病情进展，TXNIP低表达可能导致癌细胞增殖能力增强，同时促进转移，推动CRC病情进展。进一步行预后分析显示，TXNIP阳性表达患者总生存率高于阴性表达者，初步证明TXNIP与CRC患者的预后有关，TXNIP阴性表达者预后较差。回归分析发现，TXNIP阴性表达是CRC预后的危险因素，表明TXNIP蛋白阴性表达对CRC进展起推动作用，分析其原因，TXNIP阴性表达导致对癌细胞葡萄糖摄取抑制减弱，癌细胞增殖、转移，加重病情恶化，治疗难度较大，不利于预后。

KLF广泛存在于各种组织中，已被证明可控制细胞增殖、凋亡、迁移和分化等过程。KLF9是KLF家族成员之一，通过激活或抑制具有丰富GC盒的启动子调节基因表达，KLF9的异常表达可导致细胞紊乱，影响癌症发生^[17]。KLF9作为肿瘤抑制因子通常在多种恶性肿瘤中下调，LI等^[18]发现KLF9可通过抑制MMP28转录而抑制胃癌细胞的侵袭和转移；FANG等^[19]证明miR-20a-5p通过靶向抑制KLF9加速非小细胞肺癌的增殖和侵袭。本研究发现，KLF9在CRC组织中阳性表达低于癌旁组织，提示KLF9参与CRC的恶性进展。circNOL10通过在CRC中海绵化miR-135a-5p和miR-135b-5p调控KLF9表达，进而调控CRC细胞周期进展、增殖、侵袭等^[5]。有研究^[20]表明，KLF9表达降低与淋巴结转移、低分化、高临床分期有关，影响乳腺癌患者的生存。本研究进一步分析发现，KLF9蛋白表达与CRC TNM分期、淋巴结转移有关，其低表达促进CRC恶性进展。生存分析显示，KLF9阳性表达者生存率（88.24%）高于阴性表达者（66.07%），提示KLF9低表达者预后较差，靶向KLF9表达可能是CRC治疗的一个潜在靶点。分析其原因，KLF9表达降低对CRC癌细胞恶性行为抑制减弱，从而促进疾病进展。回归分析显示，KLF9阴性表达是CRC预后不良的危险因素，进一步证明KLF9与CRC预后不良密切相关，KLF9可能是评估CRC预后的潜在指标。此外，本研究还发现，CRC组织中TXNIP与KLF9表达呈正相关，推测二者可能共同参与调控CRC发病过程，但具体机制尚有待明确。

综上所述，本研究结果显示，CRC组织中TXNIP、KLF9呈低表达，其表达与TNM分期、淋巴结转移有关，参与CRC的发生、发展，且TXNIP、KLF9阴性表达者总生存率较低，可作为CRC术后预后评估指标。但由于本研究纳入病例数较少，结果可能存在偏倚，后续将继续收集病例，以验证本研究结果，并通过构建动物模型等方式深入探讨TXNIP、KLF9对CRC发生、发展的影响机制。