2024, Vol. 53文章信息
- 王小虎, 李亚灵
- WANG Xiaohu, LI Yaling
- lncRNA SNAI3-AS1调节miR-367-3p/SOX4轴对前列腺癌细胞恶性生物学行为的影响
- Effects of lncRNA SNAI3-AS1 on the malignant biological behavior of prostate cancer cells by regulating the miR-367-3p/SOX4 axis
- 中国医科大学学报, 2024, 53(10): 914-922
- Journal of China Medical University, 2024, 53(10): 914-922
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文章历史
- 收稿日期：2023-11-23
- 网络出版时间：2024-10-10 14:51:37
引用本文 |
前列腺癌（prostate cancer，PC）是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，发病率及死亡率均较高[1]。由于PC早期症状的非特异性以及复杂的发病机制，目前缺乏早期的临床诊断和治疗手段[2]，因此迫切需要探索新的有效分子靶点。长链非编码RNA（long chain non-coding RNA，lncRNA）是长度超过200个核苷酸且不具有蛋白质编码能力的转录物，因其在调控肿瘤发生和转移方面的潜力而受到广泛关注[3]。lncRNA SNAI3-AS1已被鉴定为位于扩增的16q24基因的lncRNA，被认为是一种癌基因，在肝癌细胞中表达增加[4]，但其在PC中的表达尚未见报道。lncRNA可以作为内源性RNA充当微RNA（microRNA，miRNA）海绵，抑制miRNA对其靶基因RNA的降解作用[5]。生物信息学显示，miR-367-3p与SNAI3-AS1、高迁移率族盒蛋白4（high-mobility group box protein 4，SOX4）存在结合位点，且miR-367-3p在PC组织中表达下调，过表达miR-367-3p可抑制PC细胞的增殖、侵袭和转移[6]。SOX4在PC组织和细胞中高表达，其水平下调显著抑制了PC细胞的增殖[7]。本研究探讨SNAI3-AS1在PC进展中可能发挥的作用，旨在为PC治疗提供潜在靶点。
1 材料与方法 1.1 细胞及组织来源人PCa细胞系DU145、LNCap、PC-3及正常前列腺上皮细胞系RWPE-1由BeNa培养物保藏中心提供；细胞在含10%胎牛血清DMEM培养基中培养，并在37 ℃，5% CO2培养箱中孵育，每隔3 d更换1次培养基。
35例PC组织和癌旁组织取自我院手术切除的PC患者。所有PC患者由病理检查确诊，且未接受术前放疗或化疗。本研究经我院伦理委员会批准（审批号：2020-140）。PC组织和癌旁组织均保存在-80 ℃的液氮中，用于进一步研究。
1.2 主要材料PrimeScript RT试剂盒购自日本TaKaRa公司，Hoechst33258染色液购自北京索莱宝科技有限公司，SNAI3-AS1小干扰RNA（si-RNAI3-AS1）和阴性对照（si-NC）、SNAI3-AS1过表达质粒（vector SNAI3-AS1）和阴性对照（vector）购自上海吉玛制药技术有限公司，miR-367-3p抑制剂（miR-367-3p inhibitor）、miR-367-3p模拟物（miR-367-3p mimics）及阴性对照（NC inhibitor、NC mimics）购自广州锐博生物技术有限公司，TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司，SOX4抗体购自英国abcam公司。
1.3 细胞分组及处理取对数生长期的LNCap进行实验，分为空白组、vector组、vector SNAI3-AS1组、si-NC组、si-SNAI3-AS1组、si-SNAI3-AS1+NC inhibitor组、si-SNAI3-AS1+miR-367-3p inhibitor组。除空白组不做处理外，其余各组均通过Lipofectamine™2000转染试剂将上述质粒转染或共转染至细胞中，48 h后通过实时PCR检测转染效率。
1.4 实时PCR检测细胞及组织中SNAI3-AS1、miR-367-3p、SOX4 mRNA表达水平采用TRIzol试剂从细胞和组织样品中分离总RNA，随后通过PrimeScript RT试剂盒逆转录成第一链cDNA，根据SYBR Premix EX Tap试剂盒进行实时PCR反应。引物序列见表 1。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，共40个循环。以β-actin、U6为参照，采用2-ΔΔCt法计算SNAI3-AS1、miR-367-3p、SOX4 mRNA相对表达量。
| Primer name | Direction | Primer sequence（5’- 3’） |
| SNAI3-AS1 | Forward | GCGTTATGTCGTTTGGTTGATG |
| Reversed | TGGCAGGAATGAGGTGAGC | |
| miR-367-3p | Forward | TTCTCCGAACTTTGCACGTTT |
| Reversed | ACGTGACACGTTCGGAGAATT | |
| SOX4 | Forward | GGCCTCGAGCTGGGAATCGC |
| Reversed | GGCCTCGAGCTGGGAATCGC | |
| β-actin | Forward | CACCATTGGCAATGAGCGGTTC |
| Reversed | AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT | |
| U6 | Forward | CACTGTTCCACCCCTCAGAGC |
| Reversed | GCCACTTGTCGGCGATAAGG |
1.5 克隆形成实验检测细胞克隆形成能力
将转染后的细胞接种到6孔板中，用含有10% 胎牛血清的培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养14 d，每2~3 d更新一次培养基，随后用4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色，洗去多余染色液，在倒置显微镜下计数染色的细胞克隆。
1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭在Transwell下室中加入含10% 胎牛血清的培养基作为化学引诱剂，在上室中加入不含胎牛血清的细胞悬浮液。孵育24 h后，从上室中取出未能迁移或侵入的细胞，迁移或侵入的细胞用4%多聚甲醛固定10 min，然后用0.5%结晶紫染色。在随机视野中于倒置显微镜下计数细胞。
1.7 Hoechst33258染色检测细胞凋亡收集1.6中细胞，经醋酸乙醇固定后，加入Hoechst33258染色液染色，随后清洗细胞，加入抗荧光猝灭剂进行封片处理，随机选取视野于荧光显微镜下观察细胞凋亡变化。
1.8 miR-367-3p与SNAI3-AS1、SOX4的靶向关系验证PCR扩增含有miR-367-3p预测结合位点的SNAI3-AS1和SOX4片段，随后将扩增的SNAI3-AS1、SOX4克隆至双荧光素酶表达载体以构建野生型SNAI3-AS1、SOX4（SNAI3-AS1‐WT、SOX4‐WT），突变型SNAI3-AS1、SOX4（SNAI3-AS1‐MUT、SOX4‐MUT）通过相同的方法构建。随后将WT和MUT质粒与miR-367-3p模拟物、阴性对照一起共转染入LNCap，转染48 h后，裂解细胞，并使用双荧光素酶测定系统评估相对荧光素酶活性。
1.9 Western blotting检测SOX4蛋白表达水平用含有放射免疫沉淀法裂解缓冲液溶解细胞，高速离心后，收集上清液，在100 ℃水浴中加热10 min使蛋白质变性。然后通过电泳分离蛋白质样品，并转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭，然后将膜分别与抗SOX4抗体共同孵育。用TBST洗涤膜3次，然后与二抗在室温下孵育。将化学增强发光试剂加入膜中，使用成像系统检测信号，ImageJ软件用于蛋白质定量。
1.10 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计分析，数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，进一步行SNK-q检验，2组比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 细胞及组织中SNAI3-AS1、miR-367-3p和SOX4 mRNA表达水平与RWPE-1相比，DU145、LNCap、PC-3中SNAI3-AS1、SOX4 mRNA表达显著增加，miR-367-3p表达显著降低（P < 0.05），见表 2。鉴于LNCaP中以上3个基因的表达差异较RWPE-1最大，故选择其作为后续的研究对象。与癌旁组织相比，PC组织中SNAI3-AS1、SOX4 mRNA表达显著增加，但miR-367-3p表达显著降低（P < 0.05）。见表 3。
| Cell | SNAI3-AS1 | miR-367-3p | SOX4 mRNA |
| RWPE-1 | 0.97±0.10 | 0.96±0.10 | 0.93±0.10 |
| PC-3 | 1.42±0.161） | 0.62±0.081） | 1.38±0.151） |
| DU145 | 1.48±0.161） | 0.59±0.071） | 1.44±0.161） |
| LNCap | 2.01±0.231） | 0.42±0.051） | 1.94±0.211） |
| 1）P < 0.05 vs. RWPE-1. | |||
| Group | SNAI3-AS1 | miR-367-3p | SOX4 mRNA |
| Paracancer tissue | 0.94±0.10 | 0.93±0.10 | 0.97±0.10 |
| PC tissue | 1.96±0.211） | 0.43±0.061） | 2.07±0.221） |
| 1）P < 0.05 vs. paracancer tissue. | |||
2.2 过表达SNAI3-AS1对LNCap中SNAI3-AS1、miR-367-3p、SOX4表达及生物学行为的影响
与空白组和vector组相比，vector SNAI3-AS1组SNAI3-AS1、SOX4 mRNA及蛋白表达、克隆数、侵袭与迁移显著增加，miR-367-3p表达、凋亡显著降低（P < 0.05），见图 1、2，表 4。
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| A, clonal; B, apoptosis; C, migration and invasion (×200). 图 1 LNCap克隆能力、凋亡、侵袭与迁移变化 Fig.1 Changes of clonal ability, apoptosis, invasion, and migration of LNCap |
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| 1, control group; 2, vector group; 3, vector SNAI3-A group. 图 2 细胞中SOX4蛋白表达 Fig.2 Expression of SOX4 protein in cells |
| Item | Control | Vector | Vector SNAI3-AS1 |
| SNAI3-AS1 | 0.92±0.10 | 1.02±0.11 | 1.64±0.181）,2） |
| miR-367-3p | 0.95±0.10 | 1.06±0.11 | 0.42±0.061）,2） |
| SOX4 mRNA | 0.98±0.10 | 1.05±0.11 | 1.65±0.181）,2） |
| SOX4/β-actin | 0.46±0.06 | 0.51±0.07 | 0.88±0.101）,2） |
| Clone number | 125.34±15.34 | 126.11±15.76 | 186.52±20.011）,2） |
| Apoptosis rate（%） | 8.63±0.89 | 8.55±0.88 | 4.22±0.451）,2） |
| Migration number | 211.03±23.52 | 223.13±24.31 | 300.51±32.051）,2） |
| Invasion number | 141.55±15.44 | 142.31±15.67 | 216.34±22.371）,2） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs.vector group. | |||
2.3 干扰SNAI3-AS1对LNCap SNAI3-AS1、miR-367-3p、SOX4表达及生物学行为的影响
与空白组和si-NC组相比，si-SNAI3-AS1组SNAI3-AS1、SOX4 mRNA及蛋白表达、克隆数、侵袭与迁移显著降低，miR-367-3p表达、凋亡显著增加（P < 0.05），见图 3、4，表 5。
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| A, clonal; B, apoptosis; C, migration and invasion (×200). 图 3 LNCap克隆能力、凋亡、侵袭与迁移的变化 Fig.3 Changes of clonal ability, apoptosis, invasion, and migration of LNCap |
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| 1, control group; 2, si-NC group; 3, si-SNAI3-A group. 图 4 LNCap中SOX4蛋白表达 Fig.4 Expression of SOX4 protein in LNCap |
| Item | Control | si-NC | si-SNAI3-AS1 |
| SNAI3-AS1 | 0.93±0.11 | 1.05±0.11 | 0.44±0.061）,2） |
| miR-367-3p | 0.96±0.10 | 1.03±0.11 | 1.88±0.201）,2） |
| SOX4 mRNA | 0.91±0.09 | 0.99±0.10 | 0.41±0.061）,2） |
| SOX4/β-actin | 0.49±0.06 | 0.46±0.06 | 0.13±0.021）,2） |
| Clone number | 126.08±15.46 | 126.24±15.68 | 84.55±10.211）,2） |
| Apoptosis rate（%） | 8.77±0.89 | 8.62±0.89 | 15.34±1.661）,2） |
| Migration number | 219.11±22.95 | 213.66±22.78 | 143.52±15.111）,2） |
| Invasion number | 141.77±15.52 | 141.53±15.42 | 82.24±9.021）,2） |
| 1）P < 0.05 vs. control group；2）P < 0.05 vs. si-NC group. | |||
2.4 miR-367-3p与SNAI3-AS1、SOX4的靶向关系验证
如图 5、6所示，miR-367-3p与SNAI3-AS1、SOX4存在结合位点。
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| 图 5 miR-367-3p与SNAI3-AS1的预测结合位点 Fig.5 Predicted binding sites of miR-367-3p and SNAI3-AS1 |
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| 图 6 miR-367-3p与SOX4的预测结合位点 Fig.6 Predicted binding sites of miR-367-3p and SOX4 |
miR-367-3p mimics+SNAI3-AS1-WT组荧光素酶活性（0.42±0.06）较mimics NC+SNAI3-AS1-WT组（1.03±0.11）显著降低（P < 0.05），mimics NC+SNAI3-AS1-MUT组（1.06±0.11）与miR-367-3p mimics+SNAI3-AS1-MUT组（1.04±0.11）荧光素酶活性比较无统计学差异（P > 0.05）。
miR-367-3p mimics+SOX4-WT组荧光素酶活性（0.48±0.06）较mimics NC+SOX4-WT组（1.08±0.11）显著降低（P < 0.05），mimics NC+SOX4-MUT组（1.04±0.11）与miR-367-3p mimics+SOX4-MUT组（1.04±0.11）荧光素酶活性差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.5 抑制miR-367-3p逆转干扰SNAI3-AS1对LNCap SNAI3-AS1、miR-367-3p、SOX4表达及生物学行为的影响与si-SNAI3-AS1+NC inhibitor组相比，si-SNAI3-AS1+miR-367-3p inhibitor组SOX4 mRNA及蛋白表达、克隆数、侵袭与迁移显著增加，miR-367-3p表达、凋亡显著降低（P < 0.05），SNAI3-AS1表达无统计学差异（P > 0.05）。见图 7、表 6、图 8。
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| A, clonal; B, apoptosis; C, migration and invasion (×200). 图 7 LNCap克隆能力、凋亡、侵袭与迁移变化 Fig.7 Changes of clonal ability, apoptosis, invasion, and migration of LNCap |
| Group | si-SNAI3-AS1+NC inhibitor | si-SNAI3-AS1+miR-367-3p inhibitor | |
| SNAI3-AS1 | 0.46±0.06 | 0.45±0.06 | |
| miR-367-3p | 1.82±0.20 | 1.24±0.131） | |
| SOX4 mRNA | 0.44±0.06 | 0.99±0.101） | |
| SOX4/β-actin | 0.15±0.02 | 0.42±0.061） | |
| Clone number | 84.88±10.19 | 119.97±12.351） | |
| Apoptosis rate（%） | 15.28±1.59 | 10.42±1.111） | |
| Migration number | 142.94±14.89 | 200.84±20.961） | |
| Invasion number | 82.62±8.89 | 131.77±14.061） | |
| 1）P < 0.05 vs. si-SNAI3-AS1+NC inhibitor group. | |||
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| 1, si-SNAI3-AS1+NC inhibitor group; 2, si-SNAI3-AS1+miR-367-3p inhibitor group. 图 8 LNCap中SOX4蛋白表达 Fig.8 Expression of SOX4 protein in LNCap |
3 讨论
PC是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一，由于早期PC缺乏特异性症状，确诊时往往已经发展到中晚期，错过了最佳治疗时间[8]。因此，迫切需要寻找PC新的生物标志物以制定相应的治疗方案，延长患者的生存时间，提高患者的生活质量。
lncRNA是 > 200个核苷酸的RNA转录物，虽然不能编码蛋白质，但在转录后可调节基因表达[9]。研究[10]发现lncRNA在人类多种疾病中异常表达。失调的lncRNA可导致PC进展，如lncRNA CCAT1表达在PC组织中异常上调，lncRNA BLACAT1的抑制可阻止癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡[11]。SNAI3-AS1位于Xp11.23，是新发现的一种lncRNA，研究[12]证明SNAI3‐AS1在肝细胞癌中高表达，并与肝细胞癌患者肿瘤大小和TNM分期显著相关，可能作为癌基因发挥作用。本研究发现SNAI3-AS1在DU145、LNCap、PC-3及PC组织中显著上调，提示SNAI3-AS1异常表达可能与PC的发生发展有关。上调SNAI3-AS1表达能够显著促进LNCap克隆数、侵袭与迁移，其凋亡显著被抑制；干扰SNAI3-AS1表达能够显著抑制LNCap克隆数、侵袭与迁移，促进LNCap凋亡，提示SNAI3-AS1在PC中作为癌基因发挥抑制肿瘤增殖、侵袭与迁移，促进其凋亡的作用。
miRNA是一种长度约为22个核苷酸的非编码RNA，其异常表达与包括PC在内的肿瘤的发生和发展密切相关[13]。miR-367-3p是许多miRNA家族的成员之一，但miR-367-3p与PC的关系鲜有报道。先前过表达的miR-367-3p通过下调SPAG5介导的Wnt/β-连环蛋白信号抑制宫颈癌细胞的侵袭和增殖[14]。miR-367-3p在PC细胞及组织中显著下调，提示miR-367-3p异常表达可能参与PC的发生。
lncRNA可以作为内源竞争RNA发挥miRNA海绵的作用，抑制miRNA对其靶基因RNA的降解作用[15]。如lncRNA SNHG14通过靶向miR-5590-3p调节YY1表达，从而促进PC肿瘤的发生[16]。敲除lncRNA LOXL1-AS1可以通过miR-541-3p/CCND1轴抑制PC的发生和发展[17]。生物信息学分析结果显示，SNAI3-AS1与miR-367-3p之间存在结合位点，且双荧光素酶报告基因实验及实时PCR检测SNAI3-AS1直接与miR-367-3p结合，充当PC细胞中SNAI3-AS1的海绵，靶向负调节miR-367-3p的表达。SOX4是一种重要转录因子，在人类多种恶性肿瘤中过度表达并与不良临床结局相关[18]。多项研究[19-20]表明，SOX4在调节肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭中发挥关键作用。本研究通过双荧光素酶实验及实时PCR检测miR-367-3p可以直接与SOX4的3’非翻译区相互作用，并抑制SOX4在PC细胞中的表达，提示SNAI3-AS1在PC中的抗肿瘤作用是通过上调miR-367-3p/SOX4轴实现的。
为进一步验证实验结论，实验以miR-367-3p抑制剂进行回复验证，结果发现miR-367-3p抑制剂逆转了干扰SNAI3-AS1对LNCap恶性行为的抑制作用，表明干扰SNAI3-AS1可以抑制LNCap克隆、侵袭及迁移，并促进其凋亡，其具体机制可能与上调miR-367-3p/SOX4轴有关。
综上所述，干扰SNAI3-AS1可以通过上调miR-367-3p/SOX4轴抑制LNCap克隆、侵袭及迁移，促进其凋亡，为PC治疗提供潜在生物标志物和治疗靶点，但由于具体机制较为复杂，需要开展相关实验进一步研究探讨。
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