甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，可根据组织病理学特征和分化程度分为高分化甲状腺癌（well-differentiated thyroid cancer，WDTC）、低分化甲状腺癌（poorly-differentiated thyroid cancer，PDTC）和未分化甲状腺癌（anaplastic thyroid cancer，ATC）^[1]。ATC仅占所有甲状腺癌的2%~5%，却导致40%~50%的甲状腺癌相关死亡^[1]。ATC具有高增殖率和侵袭性的特征，患者的预后较差，中位生存期仅为3~5个月，1年生存率仅为10%~20%^[2]。ATC的治疗方案十分有限且基本无效^[3]。因此，明确ATC发展的分子机制对开发治疗潜在靶点有重要意义。

E2F蛋白是一个转录因子家族，在恶性肿瘤中处于激活状态，介导视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，Rb）依赖的途径，参与细胞周期进程、凋亡、分化、DNA损伤修复、代谢和血管生成的调节^[4]。E2F蛋白分为典型E2F和非典型E2F，典型的E2F包含保守的DBD结构域和二聚体结构域，分别结合DNA和蛋白，其与DP蛋白相互作用，通过结合靶基因调节转录^[4]。E2F7是E2F家族的非典型成员，以不依赖于Rb的方式在不同肿瘤中发挥作用，其含有2个单独的DNA结合域，以DP非依赖的方式与靶基因启动子结合^[5]。E2F7可能通过与E2F1竞争结合靶基因的共有E2F结合位点抑制靶基因转录^[6]。此外，E2F7还能以不依赖E2F1的方式与CDH1启动子结合^[7]。E2F7具有两面性，可在肺腺癌、肝癌和头颈癌等肿瘤中发挥促癌作用^[8]，还可抑制皮肤癌等肿瘤的发展^[9]。研究^[10-11]发现E2F7在ATC组织中表达上调。并能促进分化型甲状腺癌向ATC的去分化。这些研究结果提示E2F7可能促进ATC发展。然而，E2F7在ATC发生发展过程中的作用机制尚不清楚。本研究通过体外和体内实验验证了E2F7对ATC发展的促进作用，并进一步探讨了其发挥作用的分子机制，旨在为其作为ATC的诊断标志物和治疗靶点提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 主要材料和仪器

人ATC细胞系CAL-62购自武汉普诺赛生命科技有限公司；BALB/c Nude裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、化学发光检测系统购自美国Promega公司；总RNA提取、SYBR qPCR试剂盒和逆转录试剂盒均购自日本TaKaRa公司；Lipofectamine3000转染试剂、BCA蛋白定量试剂盒、酶标仪和实时荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；CXCR2、p-ERK1/2、ERK和GAPDH抗体购自英国abcam公司；普通PCR仪购自美国Applied Biosystems公司；全自动化学发光分析系统购自上海天能生命科学有限公司。

1.2 实时PCR

TRIzol法提取细胞总RNA，通过逆转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，严格按照SYBR qRT-PCR试剂盒说明书进行实时PCR检测。反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s循环反应，40个循环。以GAPDH为内参，根据2-ΔΔCt法计算E2F7和CXCL5 mRNA的相对表达量。

1.3 细胞培养和转染

CAL-62细胞用含10%胎牛血清和1%青链霉素的DMEM高糖培养基在37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养。细胞分为sh-NC组、sh-E2F7组、sh-E2F7+空载体组和sh-E2F7+CXCL5组。sh-NC组CAL-62细胞转染敲减对照慢病毒，sh-E2F7组、sh-E2F7+空载体组和sh-E2F7+CXCL5组转染敲减E2F7慢病毒。各组细胞严格按照慢病毒说明书进行转染，并用嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞。sh-E2F7+空载体组和sh-E2F7+CXCL5组在稳定转染敲减E2F7慢病毒的基础上，严格按照Lipofectamine3000转染试剂说明书，分别转染空载体和CXCL5过表达质粒。

1.4 CCK-8实验

将各组细胞以2×10³/孔的密度接种于96孔板中，共接种4块包含各组细胞的96孔板。培养过夜后，分别于0、24、48和72 h取1块96孔板，弃去培养基，加入CCK-8检测试剂，37℃孵育1 h后，酶标仪检测450 nm吸光度值。

1.5 Transwell实验

Transwell小室的上室包被或不包被基质胶，分别用于细胞侵袭和迁移的检测。将各组细胞以1×10⁵/孔的密度接种于Transwell小室上室，向上室中加入无血清培养基，下室中加入含20%胎牛血清的培养基，继续培养24 h后取出上室，PBS洗涤后加入4%多聚甲醛，室温固定10 min，PBS洗涤3次，结晶紫染色1 h，蒸馏水漂洗，倒置显微镜下观察拍照。

1.6 裸鼠成瘤模型

收集稳定转染的细胞并计数，PBS重悬细胞，将细胞稀释至1×10⁷/mL。取100 μL细胞悬液，加入30 μL基质胶，将混匀后的悬液皮下注射裸鼠。继续饲养，每隔3 d用游标卡尺检测移植瘤的长径和短径并计算肿瘤体积。饲养21 d后，脱颈椎法处死裸鼠，取出移植瘤，称量肿瘤质量。

1.7 Western blotting

收集组织或细胞，使用RIPA裂解液提取组织或细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，煮样使蛋白样品充分变性，将其上样于聚丙烯酰胺凝胶，SDS-PAGE电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，PBST洗膜，二抗室温孵育1 h，PBST洗膜，ECL化学发光，采用ImageJ软件进行灰度分析。

1.8 双荧光素酶报告基因实验

应用EPD网站预测CXCL5启动子是否存在E2F7的潜在结合位点。克隆CXCL5启动子全长，使用pGL3载体构建CXCL5启动子的荧光素酶报告基因质粒。将CXCL5启动子的荧光素酶报告基因质粒转染sh-NC组和sh-E2F7组的CAL-62细胞，继续培养24 h后，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性。

1.9 ELISA

收集各组细胞培养基，离心后取上清，严格按照ELISA检测试剂盒说明书检测细胞培养基中CXCL5水平。

1.10 统计学分析

采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 9.4.0软件进行统计学分析。数据均符合正态分布，以x±s表示。2组比较采用独立样本t检验；多组间的比较采用单因素方差分析，并采用Tukey事后检验进行组间两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 实时PCR检测转染效率

各组CAL-62细胞稳定转染后，采用实时PCR检测转染后E2F7 mRNA表达，结果显示，转染sh-E2F7慢病毒后，CAL-62细胞E2F7 mRNA的表达下降（P < 0.05），表明E2F7敲减慢病毒转染成功。见图 1。

2.2 下调E2F7对CAL-62细胞增殖、迁移和侵袭的影响

CCK-8检测结果显示，与sh-NC组比较，sh-E2F7组CAL-62细胞的增殖能力下降（P < 0.05，图 2A）。Transwell迁移实验结果显示，与sh-NC组比较，sh-E2F7组CAL-62细胞的迁移能力下降（P < 0.05，图 2B）。Transwell侵袭实验结果显示，与sh-NC组比较，sh-E2F7组CAL-62细胞的侵袭能力下降（P < 0.05，图 2C）。提示敲减E2F7能够抑制ATC CAL-62细胞增殖、迁移和侵袭能力。

2.3 下调E2F7对CAL-62细胞移植瘤肿瘤生长的影响

裸鼠皮下注射稳定转染的细胞，观察敲减E2F7对CAL-62细胞移植瘤肿瘤生长的影响，结果显示，与sh-NC组比较，sh-E2F7组CAL-62细胞移植瘤的肿瘤体积减小、质量下降（P < 0.05）。表明敲减E2F7能够抑制ATC CAL-62细胞体内肿瘤生长。见图 3。

2.4 E2F7靶向调控CXCL5的表达

EPD网站（https://epd.expasy.org/epd）在线预测结果显示，CXCL5启动子存在E2F7的潜在结合位点（图 4A）。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，与sh-NC组比较，sh-E2F7组转染pGL3-CXCL5启动子荧光素酶报告基因质粒的CAL-62细胞的荧光素酶活性下降（P < 0.05，图 4B）。实时PCR检测结果显示，与sh-NC组比较，sh-E2F7组CAL-62细胞CXCL5 mRNA的表达下降（P < 0.05，图 4C）。ELISA检测结果显示，与sh-NC组比较，sh-E2F7组CAL-62细胞培养基中CXCL5水平下降（P < 0.05，图 4D）。提示E2F7能促进CXCL5的转录。

2.5 过表达CXCL5逆转了下调E2F7表达对CAL-62细胞增殖、迁移和侵袭的影响

CCK-8检测结果显示，与sh-E2F7+空载体组比较，sh-E2F7+CXCL5组CAL-62细胞的增殖能力升高（P < 0.05，图 5A）。Transwell迁移实验结果显示，与sh-E2F7+空载体组比较，sh-E2F7+CXCL5组CAL-62细胞的迁移能力升高（P < 0.05，图 5B）。Transwell侵袭实验结果显示，与sh-E2F7+空载体组比较，sh-E2F7+CXCL5组CAL-62细胞的侵袭能力升高（P < 0.05，图 5C）。提示过表达CXCL5逆转了下调E2F7表达对CAL-62细胞增殖、迁移和侵袭的影响。

2.6 过表达CXCL5逆转了下调E2F7表达对CAL-62细胞CXCR2/ERK信号通路的影响

Western blotting检测结果显示，与sh-NC组比较，sh-E2F7组CAL-62细胞CXCR2和p-ERK1/2的表达下降（P < 0.05），ERK的表达无明显差异（P > 0.05，图 6A）。与sh-E2F7+空载体组比较，sh-E2F7+CXCL5组CAL-62细胞CXCR2和p-ERK1/2的表达升高（P < 0.05），ERK的表达无明显差异（P > 0.05，图 6B）。提示过表达CXCL5逆转了下调E2F7表达对CAL-62细胞CXCR2/ERK信号通路的影响。

3 讨论

E2F7能够促进甲状腺癌的进展。GUO等^[12]发现与正常甲状腺细胞相比，E2F7在甲状腺乳头状癌细胞中表达上调，抑制其表达可抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移和侵袭。最近，GUGNONI等^[11]发现E2F7在ATC组织中表达较分化型甲状腺癌组织上调，沉默E2F7降低了ATC细胞增殖、克隆形成和迁移能力。此外，E2F7能够促进分化型甲状腺癌向ATC的去分化。

本研究建立了稳定敲减E2F7的ATC CAL-62细胞模型，并进一步检测了敲减E2F7对CAL-62细胞体外增殖、迁移、侵袭及体内肿瘤生长的影响。结果显示，敲减E2F7降低了CAL-62细胞体外增殖、迁移和侵袭能力，并抑制了CAL-62细胞体内肿瘤生长，提示其促进ATC发展，这与GUGNONI等^[11]的研究结果一致。

CXCL5是一种通过结合CXCR2募集中性粒细胞的C-X-C趋化因子，CXCL5/CXCR2轴与癌症患者生存时间、复发和转移密切相关^[13]。CUI等^[14]的研究发现CXCL5/CXCR2轴增强了AKT和GSK-3β的磷酸化，加速了细胞中β-catentin的核积累，从而促进甲状腺乳头状癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化。CUI等^[15]的另一项研究发现，CXCL5/CXCR2轴的激活还能通过激活JNK和p38信号通路促进甲状腺乳头状癌细胞G₁到S期的细胞周期转变。生物信息学研究^[10]发现，CXCL5在ATC组织中表达上调，且E2F7和CXCL5在ATC中的表达呈正相关。本研究通过EPD在线数据库分析了CXCL5启动子区的E2F7潜在结合位点，发现CXCL5启动子区存在E2F7的结合位点。E2F7可促进下游靶基因转录。WANG等^[16]发现E2F7与CISD2启动子结合并上调其表达，从而促进宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭并抑制其凋亡。还有研究^[17]发现E2F7结合EZH2启动子促进其转录，EZH2将H3K27me3募集到PTEN的启动子并抑制PTEN的表达，激活AKT/mTOR信号通路，从而促进胶质瘤的发展。因此，本研究推测E2F7可能通过结合CXCL5启动子促进其转录。本研究发现敲减E2F7降低CXCL5启动子的转录活性，并降低了CXCL5的表达。鉴于E2F7缺乏激活基因转录的反式激活结构域，本研究推测E2F7可能作为辅激活因子参与CXCL5转录的调控，与E2F7协同调节CXCL5转录的其他激活剂有待进一步探究。此外，本研究还发现，过表达CXCL5逆转了敲减E2F7对ATC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，进一步证明了E2F7通过上调CXCL5促进ATC发展。

ERK通路在细胞增殖、细胞存活和转移中具有重要作用，其异常激活可能参与包括甲状腺癌在内的多种肿瘤的进展^[18]。抑制ERK信号通路可以改善ATC进展^[19]。研究^[20]表明，CXCL5/CXCR2轴通过激活ERK/GSK-3β/Snail信号通路促进鼻咽癌细胞上皮-间质转化。本研究发现敲减E2F7抑制了CXCL5/CXCR2/ERK信号通路的激活，而过表达CXCL5逆转了敲减E2F7对CXCL5/CXCR2/ERK信号通路的抑制作用。

综上所述，E2F7能够促进ATC细胞体外增殖、迁移、侵袭和体内肿瘤生长，其机制可能与促进CXCL5转录介导的CXCL5/CXCR2/ERK信号通路的激活有关。