脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）可导致运动和感觉功能障碍，严重危害患者的生命^[1-3]。SCI分为原发性损伤和继发性损伤。原发性SCI由压迫、撕裂、变形或剪切引起，常导致轴突骨折、神经组织破坏和神经元凋亡。经过一系列复杂的反应，原发性SCI可迅速发生继发性损伤，导致受累区域的神经元凋亡^[7]。目前SCI缺乏有效的药物和治疗方法，因此，对SCI创新治疗方法的探索至关重要。近年来，随着医疗设备和技术的进步，夹脊电针（Jiaji electroacupuncture，EA）已成为治疗各种疾病的热点。研究^[3-5]表明，EA是治疗肥胖、脑卒中和糖尿病周围神经病变的有效且安全的方法^[6-7]。尽管EA已被证明是治疗SCI的有效方法，EA对SCI后神经元凋亡的作用机制仍不清楚。

脊髓神经元对缺血、缺氧极为敏感，再灌注是缺血、缺氧的主要治疗手段。然而，在某种内源性损伤机制的作用下，脊髓神经元缺血一定时间后，即使血液再灌注，脊髓神经元也会发生不可逆的迟发性死亡^[8-9]。脊髓缺血再灌注损伤的机制涉及下调胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表达，从而抑制其对损伤脊髓神经元的保护和修复作用^[9-10]。研究^[11-12]表明，信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路在疾病早期被激活并介导氧化应激、炎症细胞反应及神经元凋亡。然而，在SCI中EA是否能通过GFAP/STAT3信号通路改善神经元损伤尚不清楚。本研究拟通过EA对SCI模型大鼠神经功能的影响，探讨EA通过GFAP/STAT3通路影响星形胶质细胞活化保护神经元的作用机制。

1 材料与方法 1.1 实验动物、实验分组及动物模型制备

雄性SPF级SD大鼠，购自锦州医科大学实验动物中心，许可证号为SYXK [辽] 2022-0007，平均体重为（220±10）g。实验大鼠饲养在SPF级实验动物房中。大鼠适应性饲养1周后，采用随机数字表法分为sham组（仅椎板切除术）、SCI组、EA组（SCI+EA治疗）和EA+激动剂组（SCI+EA治疗+STAT3激活剂），每组10只。除sham组外，其他各组均采用Allen’s改良式重物坠落法制备SCI模型。大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉。常规消毒后暴露T_7~9棘突。T₈棘突的椎板被切除，可见硬脊膜。采用Allen的WD装置，在距离脊髓10 cm处自由投放冲击棒（5 g），撞击脊髓组织。造模后，大鼠身体和后肢收缩，尾巴摆动、痉挛，脊髓组织充血、肿胀，硬脑膜未损伤。以神经功能（Basso-Beattie-Bresnahan，BBB）评分 < 33作为判定模型制备成功的标准。sham组仅行椎板切除术，术后将大鼠置于干净且加热的垫子，直至清醒。造模后连续3 d腹腔注射青霉素（100 U/d）以防止感染。每天进行2次人工膀胱挤压，促进膀胱排空。

1.2 试剂与仪器

无菌针灸针购自苏州医疗用品厂有限公司，兔抗GFAP、STAT3、p-STAT3、cleaved caspase-3抗体购自美国Sigma公司，小鼠抗-caspase3、GAPDH购自北京博奥森生物技术公司，全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE电泳液干粉、ECL发光液购自北京索莱宝科技有限公司，PVDF膜购自美国Millipore公司，TUNEL试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司，电针治疗仪购自常州英迪电子医疗器械有限公司，倒置光学显微镜和冰冻切片机购自德国Leica公司，多功能酶标仪购自美国BIOTEK公司，电泳仪购自美国Bio-Rad公司，电热恒温培养箱购自天津泰斯特仪器有限公司。

1.3 EA治疗

在大鼠背部SCI邻近椎体上、下端T_7~9椎体旁夹脊穴进行EA治疗。垂直插入直径为0.25 mm的一次性无菌不锈钢针头，针头深度为4~5 mm，直至针尖接触椎板。连接电针仪，将两极分别按上正、下负连接到针柄上。参数设置：输出频率为100 Hz，电流强度设置为2 mA，建模后30 min、4 h、8 h分别进行1次连续波刺激，每次15 min。连续治疗28 d后取出脊髓组织。

1.4 BBB评分量表评定大鼠脊髓运动功能

采用BBB评分标准观察各组大鼠的后肢功能变化，BBB测试满分为21分（0分，完全后肢麻痹；21分，正常运动），基于在空旷场地进行的后肢运动，包括后肢关节运动、重量支撑、足底步行、协调、爪子位置以及躯干和尾巴控制。BBB评分的目的是评估整体基本运动性能。由2名对实验分组不知情的实验者评估3 min以上，其中1名实验者计算总分，分数越低代表运动功能障碍越严重。评定手术前1 d和损伤后1、3、7、14、21、28 d各组大鼠的BBB评分。

1.5 斜坡实验评价大鼠平衡能力

采用斜坡实验检测大鼠身体平衡能力。评定手术前1 d和损伤后1、3、7、14、21、28 d各组大鼠的平衡能力。EA治疗28 d后，将各组大鼠置于水平斜板上（0 °），斜板侧面设有角度板，便于调整角度。然后逐渐升至30 °作为起始角度，并以2 °/s的速度增大，直到从斜板上滑落。记录大鼠能够在斜坡上保持身体平衡超过5 s时的角度，即为最大角度值。

1.6 TUNEL染色检测脊髓组织神经元凋亡

制作脊髓组织冰冻切片，将切片从4 ℃冰箱取出后，复温10 min，用组画笔圈住组织，4%PFA溶液固定组织60 min。PBS洗涤3次，每次5 min。加入透膜液（0.1%柠檬酸+0.1%TritonX-100）室温孵育10 min。PBS洗涤2次，每次5 min。提前配置好TUNEL染色液（Enzyme∶label=1∶9），将载玻片放在避光湿盒中，在组织样品上滴加50 μL的TUNEL染色液，放入37 ℃烘箱，避光孵育60 min。PBS洗涤3次，每次10 min。采用含有DAPI的抗荧光猝灭剂封片，避光晾干后在倒置荧光显微镜下观察结果。

1.7 Western blotting检测脊髓组织的蛋白表达

EA治疗28 d后，使用戊巴比妥（50 mg/kg）对大鼠进行深度麻醉，经心室灌注200 mL生理盐水（4 ℃），并立即取出大鼠T_7~9脊髓组织储存在-80℃环境中。取脊髓组织加入RIPA裂解液提取总蛋白并测蛋白浓度。将蛋白样品加入适量的样品缓冲液和双蒸水，金属浴100 ℃，5 min。使用简易制胶剂分别制上层胶和下层胶制胶后，上样进行电泳，通过PVDF膜进行转膜。5%脱脂牛奶2 h进行封闭。加入一抗（cleaved caspase-3稀释浓度为1∶2 000；p-STAT3稀释浓度为1∶1 000；STAT3稀释浓度为1∶2 000；GFAP稀释浓度为1∶5 000），4 ℃过夜。加入二抗（稀释浓度为1∶5 000），孵育2 h。滴加ECL发光液，凝胶成像，采用ImageJ软件进行分析。

1.8 免疫荧光染色

使用戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠后，将灌流针经左心室插入主动脉注射200 mL 0.9%生理盐水后，用200 mL 4%甲醛固定。在4%甲醛中固定T7~9脊髓4 h后，30%蔗糖脱水直至脊髓组织沉底。脊髓组织通过冷冻切片机切成5 μm的脊髓切片。将切片用0.3% tritonX-100溶液处理30 min。10%山羊血清封闭1 h。滴加一抗GFAP（稀释浓度为1∶200），4 ℃过夜。次日，复温1 h。滴加二抗（1∶400），孵育1 h，注意避光。DAPI封片。使用倒置荧光显微镜观察，所有图像捕获过程中保持统一的显微镜设置。

1.9 ELISA法检测

检测大鼠脊髓组织中炎性细胞因子的水平，分别使用白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）和白细胞介素-18（interleukin18，IL-18）的ELISA试剂盒。按照试剂盒说明书操作，计算样本光密度（optical density，OD）值。

1.10 统计学分析

采用GraphPad Prism 8软件绘图。数据以x±s表示，计量资料2组比较采用两样本t检验，连续变量多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 各组大鼠运动功能障碍情况

BBB评分结果显示，SCI组的运动功能下降（P < 0.01）。EA组在7、14、21、28 d时EA组的BBB得分略高于SCI组（P < 0.01，图 1）。斜坡实验后7、14、21、28 d，SCI组的角度小于sham组（P < 0.001）。与SCI组相比，EA组在这些时间点的角度略大（P < 0.01，图 2）。以上结果表明，EA治疗在SCI后7、14、21、28 d改善了大鼠的后肢运动功能。

2.2 各组大鼠脊髓组织神经元凋亡情况

TUNEL染色检测各组大鼠脊髓组织中神经元凋亡数量。结果显示，与sham组相比，SCI组阳性细胞数明显增多（P < 0.001）。与SCI组相比，EA组阳性细胞数减少（P < 0.05）。与EA组相比，EA+激动剂组阳性细胞数明显增加（P < 0.05），见图 2。

2.3 各组大鼠脊髓中cleaved caspase-3蛋白表达

Western blotting结果显示，与sham相比，SCI组cleaved caspase-3蛋白表达显著升高（P < 0.001）。EA组cleaved caspase-3蛋白表达较SCI组降低（P < 0.01）。与EA组相比，EA+激动剂组GFAP蛋白表达明显增加（P < 0.01），见图 3。

2.4 免疫荧光染色检测大鼠脊髓中GFAP的表达

采用免疫荧光染色量化GFAP，结果显示，与sham相比，SCI组GFAP阳性表达明显增加（P < 0.01）。与SCI组相比，EA组GFAP阳性表达降低（P < 0.05）。与EA组相比，EA+激动剂组GFAP表达增加（P < 0.05）。以上结果说明，EA治疗显著抑制了SCI后GFAP的表达，然而给予STAT3激活剂后，与SCI组相比GFAP表达无明显差异（P > 0.05），见图 4。

2.5 Western blotting检测各组大鼠p-STAT3和STAT3蛋白的表达

Western blotting结果显示，与sham组相比，SCI组脊髓组织中GFAP和p-STAT3的蛋白表达水平明显增加（P < 0.01）。经EA治疗后，与SCI组相比，EA组中GFAP和p-STAT3的蛋白表达水平显著降低（P < 0.05）。而EA+激动剂组大鼠脊髓组织中GFAP和p-STAT3的蛋白表达水平与EA组相比显著增加（P < 0.04），见图 5。

2.6 ELISA检测各组大鼠炎性细胞因子的水平

ELISA结果表明，SCI组大鼠脊髓组织的IL-6，IL-1β，TNF-α和IL-18含量较sham组显著增加（P < 0.001）。EA治疗后，与SCI组对比，EA组IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-18含量明显下降（P < 0.01）。给予STAT3激活剂干预后，各炎性细胞因子的含量与SCI组无明显差异（P > 0.05），见图 6。

3 讨论

从中医的角度出发，SCI的主要病理机制为督脉损伤、肾阳不足^[13]。针刺夹脊穴可刺激机体阳气，加速全身气血循环^[14]。EA是一种传统的中医疗法，临床治疗中通常用于促进脊髓和神经肌肉损伤的恢复。夹脊穴的EA结合针灸和电场效应可以治疗SCI ^[15]，刺激起源于下椎骨的脊神经后支。研究^[7-8]表明，EA能缓解局部缺血、缺氧，抑制炎性细胞因子的分泌，减少神经细胞凋亡等，从而保护神经功能，修复损伤，对SCI有明显的改善作用。

本研究制备了SCI大鼠模型，并观察EA治疗对SCI的修复作用。结果显示，在不同时间段，SCI组大鼠的BBB评分有所下降，斜角也有所减小，SCI大鼠的运动功能和平衡能力出现了明显的损伤。与SCI组相比，EA对SCI大鼠的运动和平衡能力有明显的改善作用。本研究结果显示，EA能显著改善SCI大鼠的运动功能。然而，EA恢复SCI运动功能的机制尚不清楚。

研究^[3-4]发现，星形胶质细胞在SCI中扮演双重角色。其在SCI后分泌神经营养因子等物质，发挥神经保护作用；同时，SCI后胶质细胞活化并分泌大量炎性细胞因子，导致神经元死亡和永久性神经功能障碍。GFAP是星形胶质细胞的特异性标志蛋白，SCI后星形胶质细胞中的GFAP呈现出高表达状态，且与神经功能损伤程度密切相关^[11-13]。本研究中TUNEL实验发现SCI后神经元凋亡增加，然而，EA组神经元凋亡数量明显减少。采用免疫荧光染色和Western blotting检测胶质细胞特异性标志蛋白GFAP，发现SCI后GFAP表达增加，而EA后GFAP的表达明显减少，提示EA抑制了GFAP的表达。

STAT3在激活状态下结合GFAP启动子位点，导致酪氨酸快速磷酸化，加速星形胶质细胞活化和增殖，并促进神经元细胞损伤^[14-15]。本研究结果显示，SCI后p-STAT3和cleaved caspase-3蛋白表达显著增加，EA后降低STAT3磷酸化水平，且神经元凋亡减少。同时，通过ELISA对炎性细胞因子的检测发现，EA治疗后脊髓组织中炎性细胞细胞因子含量明显减少。然而，给予STAT3激活剂干预后，与SCI组相比，神经元凋亡及炎性细胞细胞因子含量无明显变化。以上结果表明，EA可能通过抑制GFAP表达，降低STAT3磷酸化水平，抑制神经元凋亡，进而改善SCI后运动功能的改善。

综上所述，EA治疗能够有效改善SCI大鼠神经功能损伤，恢复SCI大鼠的运动及平衡功能。其作用机制可能是通过调节GFAP/STAT3抑制星形胶质细胞的活化，从而抑制神经元凋亡。本研究为改善SCI后的神经功能恢复提供新的治疗靶点。