结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，也是全球癌症相关死亡的第3大原因，其发病率呈逐渐上升趋势^[1]。肿瘤的侵袭和远处转移是导致结直肠癌死亡率高的主要原因。目前，综合治疗手段的进步在一定程度上延长了结直肠癌患者的生存期，但转移性结直肠癌患者的预后仍较差^[2]。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的新型RNA转录物，可通过组蛋白修饰、染色质重塑以及DNA甲基化等方式调控细胞增殖、细胞周期和细胞迁移等多种生物过程，参与肿瘤的发生和发展^[3-5]。研究^[6]表明，异常表达的lncRNA也参与了结直肠癌的恶性进展，但其机制尚未明确。

lncRNA Opa互作蛋白5反义转录物1（Opa interacting protein 5-antisense RNA 1，OIP5-AS1）位于人类15号染色体q15.1上^[7]。研究^[8-10]发现，OIP5-AS1在胃癌、乳腺癌、宫颈癌的发生、发展过程中发挥重要作用。本研究重点探讨了lncRNA OIP5-AS1在结直肠癌中的表达水平及其对细胞侵袭能力的影响。

1 材料与方法 1.1 材料

人结直肠癌细胞系HCT116、SW480、HT-29和Caco-2购自中国科学院上海分院细胞库。胎牛血清购自美国Gibco公司，总RNA提取试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司，逆转录试剂盒购自上海吉玛制药技术有限公司。脂质体Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司，E钙黏蛋白（E-cadherin）抗体、N钙黏蛋白（N-cadherin）抗体、波形蛋白（Vimentin）抗体、GAPDH多克隆抗体购美国Proteintech公司，HRP标记山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒和ECL发光液购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养和转染

SW480、HT-29和Caco-2细胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，HCT116细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，所有培养基中添加100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。细胞在37 ℃、含5% CO2的加湿室中培养。按照试剂说明书，用Lipofectamine 3000试剂转染细胞，将细胞分为NC组（转染无义寡核苷酸序列）、OIP5-AS1 siRNA1组（转染干扰序列OIP5-AS1 siRNA1）和OIP5-AS1 siRNA2组（转染干扰序列OIP5-AS1 siRNA2）。

1.3 RNA提取和实时荧光定量PCR

使用Trizol试剂盒从细胞或组织中提取总RNA，按逆转录试剂盒操作步骤将提取的mRNA反转录成cDNA。为了检测OIP5-AS1的表达，合成OIP5-AS1和内参GAPDH的特异性引物。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，设置35个循环。PCR引物序列：OIP5-AS1，正向5’-TGCGAAGATGGCGGAGTAAG-3’，反向5’-TAGTTCCTCTCCTCTGGCCG-3’；GAPDH，正向5’-GACAGTCAGCCGCATCTTCT-3’，反向5’-GCG CCCAATACGACCAAATC-3’。

1.4 Western blotting检测

细胞转染48 h后，用含1 mmol/L苯甲基磺酰氟和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液从细胞中提取总蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度。在10% SDS-PAGE中加入20~30 μg蛋白样品进行电泳分析，然后转移到PDVF膜上。随后用5%脱脂奶粉封闭，用一抗在4 ℃下孵育过夜。第2天用辣根过氧化物酶偶联二抗孵育膜。采用ECL检测试剂盒检测蛋白条带。

1.5 免疫荧光染色

细胞转染48 h后，将培养板中的细胞用冰甲醇固定15 min，PBS浸洗后，细胞用0.5% TritonX-100室温通透20 min，1%山羊血清白蛋白室温封闭30 min，孵育一抗4℃过夜。第2天PBST浸洗后避光滴加荧光二抗，湿盒中孵育1 h，随后滴加DAPI，避光孵育5 min染核，浸洗后用含抗荧光淬灭的封片液封片，荧光显微镜下观察和采集图像。

1.6 细胞迁移能力分析

转染48 h后收集细胞，在无血清培养基中重悬。将6×10⁴个细胞接种到Transwell上室，上室培养基中加入无血清培养基。将含有10%血清的培养基作为化学诱导剂加入下室。在恒温培养箱中孵育16 h后，去除Transwell膜表面的细胞，将已转移到膜下的细胞用冷甲醇固定30 min，用结晶紫染色25 min。

1.7 统计学分析

使用SPSS 21软件进行统计分析。所有实验至少重复3次，取3次结果的平均值，用$\bar{x} \pm s$表示。多组间比较采用单因素方差分析，2组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 结直肠癌细胞中OIP5-AS1表达水平

与低侵袭性HT-29、Caco-2细胞相比，高侵袭性SW480和HCT116细胞中OIP5-AS1表达水平较高（均P < 0.05），SW480细胞中OIP5-AS1的表达水平显著高于HCT116、HT-29和Caco-2细胞，差异有统计学意义（P < 0.05），见图 1A。本研究选取OIP5-AS1表达水平较高的SW480和HCT116细胞。SW480和HCT116细胞分别转染siRNA序列或相应的对照序列，结果显示，OIP5-AS1 siRNA1组和OIP5-AS1 siRNA2组中OIP5-AS1表达水平均显著低于NC组（P < 0.01），见图 1B。

2.2 沉默OIP5-AS1对细胞迁移的影响

Transwell结果表明，HCT116细胞中，OIP5-AS1 siRNA1组和OIP5-AS1 siRNA2组的细胞迁移能力显著低于NC组（分别为P < 0.01和P < 0.05）；SW480细胞中，OIP5-AS1 siRNA1组和OIP5-AS1 siRNA2组的细胞迁移能力也显著低于NC组（均P < 0.01）。见图 2。

2.3 沉默OIP5-AS1对上皮-间质转化（epithelial- mesenchymal transition，EMT）标志物的影响

Western blotting结果显示，SW480和HCT116细胞中，与NC组比较，OIP5-AS1 siRNA1组和OIP5-AS1 siRNA2组中E-cadherin蛋白表达增加，N-cadherin和Vimentin蛋白表达减少（P < 0.05），见图 3。免疫荧光染色结果显示，SW480细胞中，与NC组相比，OIP5-AS1 siRNA1组和OIP5-AS1 siRNA2组中E-cadherin蛋白在细胞膜和细胞质中的表达增加，N-cadherin蛋白在细胞膜和细胞质中的表达减少，见图 4。

3 讨论

近年来，人们对lncRNA的作用机制进行了大量研究，越来越多的证据表明，lncRNA的异常表达在肿瘤生物学进展中具有重要的作用，如肿瘤发生、肿瘤进展和转移，贯穿肿瘤进展的全过程^[11-12]。因此，明确lncRNA的潜在机制将有助于开发癌症诊断和治疗的新策略。lncRNA OIP5-AS1已被证实在不同类型的癌症中作为癌基因或抑癌基因，如在肝癌和肺癌中促进肿瘤的增殖、迁移、侵袭和EMT ^[13-15]；在宫颈癌中，OIP5-AS1作为HuR的海绵或竞争性内源性RNA，抑制HuR引发的增殖表型，表现为抑癌作用^[16]。

研究^[17]表明，OIP5-AS1可以增强结直肠癌细胞的放疗敏感性，因此有望成为结直肠癌放疗的一种基因增敏剂。然而，OIP5-AS1在结直肠癌中作用的研究报道很少。本研究发现，OIP5-AS1在高侵袭性SW480和HCT116细胞中表达水平较高，而在低侵袭性HT-29和Caco-2细胞中表达水平较低。体外实验结果显示，OIP5-AS1沉默抑制了结直肠癌SW480和HCT116细胞的迁移，促进肿瘤细胞的恶性进程。笔者认为，OIP5-AS1在结直肠癌中的促侵袭作用和放疗增敏作用并不矛盾，因为同一分子可能通过调控不同的通路，影响不同的生物学行为。

在EMT过程中，上皮细胞向间质状态的转变过程中伴随着细胞表达的黏附分子改变，使其获得迁移和侵袭能力。其特点是上皮标志物（如E-cadherin）的表达减少，间质标志物（如N-cadherin和vimentin）的表达增加^[18-19]。本研究发现，在SW480和HCT116细胞中OIP5-AS1沉默均能明显上调E-cadherin的表达，下调N-cadherin和Vimentin的表达。本研究还发现，OIP5-AS1表达减少后，E-cadherin蛋白在SW480细胞的细胞膜和细胞质中分布显著增加，而N-cadherin蛋白在细胞膜和细胞质中分布显著减少，这导致肿瘤细胞间形成的黏附连接增加，使细胞间的接触增加，为相邻细胞间提供更强的机械附着，细胞极性降低，肿瘤的迁移和转移能力减弱^[20]。因此，OIP5-AS1可能通过促进EMT的发生来促进细胞迁移，在结直肠癌转移中发挥促癌作用。

综上所述，OIP5-AS1促进结直肠癌细胞的EMT过程，从而促进肿瘤的恶性进展。这为结直肠癌的治疗提供了新的方向。然而，本研究尚未明确OIP5-AS1是通过何种机制促进了EMT的发生，其具体的作用机制和调控方式有待进一步论证。