呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是导致小儿毛细支气管炎最常见的病毒^[1-2]。中医学将毛细支气管炎称为“暴喘”“马牌风”，治疗以祛痰止咳、宣肺平喘为主^[3]。定喘汤出自《摄生众妙方》，可用于治疗咳嗽喘息等病症^[4-5]。中医学注重疾病全身的发展过程，而代谢组学可动态、系统地反映机体状态，因此，代谢组学常用于中医药疗效和机制的研究^[6-7]。本研究将代谢组学应用于定喘汤治疗RSV感染的毛细支气管炎的患儿中，探讨RSV患儿与健康儿童的代谢差异以及定喘汤发挥疗效的作用机制。

1 材料与方法 1.1 一般资料

选取2016年9月至2017年2月于我院接受治疗的30例RSV感染的毛细支气管炎患儿作为研究对象（毛细组），另选取同期于我院体检的38例健康儿童作为对照组。毛细组年龄2~24个月，平均年龄（14.06±3.02）个月，男16例，女14例；对照组年龄6~18个月，平均年龄（13.59±2.46）个月，男21例，女17例，2组研究对象的一般资料比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院伦理委员会审批同意。

1.2 纳入和排除标准

1.2.1 毛细组患儿纳入标准

（1）符合RSV感染毛细支气管炎的诊断标准^[8]；（2）符合中医儿科病症诊断中咳嗽喘息的诊断依据^[9]，中医辨证为痰热蕴肺；（3）所有患儿均接受病毒检测确定为RSV，检测鼻咽部分泌物RSV抗原（+）和（或）检测血清RSV-IgM（+）；（4）患儿监护人知晓并签署知情同意书。

1.2.2 对照组儿童纳入标准

（1）身体健康；（2）无喘息病史；（3）无先天性疾病；（4）无精神障碍。

1.2.3 排除标准

（1）发病时间 > 72 h；（2）合并先天性心脏病；（3）存在支气管肺部发育不良；（4）存在支气管异物；（5）合并中枢神经系统性疾病；（6）合并结核感染或细菌性肺炎；（7）既往存在哮喘史。

1.3 试剂与仪器

液相色谱质谱系统（美国Waters ACQUITY公司，器械准字：20142401651）、质谱检测仪（美国AB Sciex公司，型号：Triple TOFTM 5600）、超纯水机（美国

Millipore公司，型号：Milli-Q，器械准字：20122450103）、乙腈（德国Merck公司）、甲酸（美国Sigma-Aldrich公司）。

1.4 方法

1.4.1 治疗方法

毛细组患儿均接受定喘汤治疗，定喘汤配方为白果（去壳，砸碎，炒黄）9 g、麻黄9 g、苏子6 g、甘草3 g、款冬花9 g、杏仁6 g、桑皮9 g、黄芩6 g、制半夏9 g。无风寒外束者酌情减少麻黄剂量，痰稠难咳者原方方剂组成剂量倍黄芩。温水煎服，15~20 mL/次，2次/ d，连续治疗10 d。

1.4.2 样品采集与处理方法

采集2组患儿治疗前后的空腹静脉血5 mL，室温静置，-80 ℃冰箱保存。检测前解冻血清，离心（8 000 r/min）10 min，取上清100 μL，加400 μL纯水涡旋1 min，再次离心10 min，提取上清液。

1.4.3 代谢组学分析方法

1.4.3.1 液相条件

通过液相色谱质谱系统，色谱柱（Hypersil GOLDTM，规格为50 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温60 ℃。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为0.1%甲酸乙腈，流速0.4 mL/min，进样量5 μL。梯度洗脱程序为0~0.5 min，5% B；0.5~2.5 min，5%~60% B；2.5~8 min，60%~100% B；保持2 min；0.1 min内回到初始比例5% B。

1.4.3.2 质谱条件

采用质谱检测仪，参数设置为质谱扫描范围80~1 000 m/z，碰撞电压10 V；信息采集扫描范围60~1 000 m/z，碰撞电压40 V；气帘流速30 psi，雾化流速55 psi，加热流速55 psi；离子源温度550 ℃，正离子喷雾电压5.5 kV；离子源温度450 ℃，负离子喷雾电压5.5 kV。

1.5 统计学分析

采用SIMCAP 11. 0软件进行统计分析，建立主成分分析（prineiple component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）2种数学模型，对其相应主成分的变量重要性（variable importance in the proect，VIP）进行计算，组间比较采用t检验，采用SPSS 25.0软件进行数据处理，差异性代谢物需同时满足VIP值> 2、P < 0. 05。

2 结果 2.1 2组代谢产物差异分析

建立OPLS-DA模型（图 1），2组分离趋势明显，说明2组的代谢产物有明显差异，响应置换检验（图 2），参数：R²Y= 0.824，Q² =0.614，说明模型有效；根据OPLS-DA模型，提取VIP > 2，同时行t检验，且满足P < 0.05，筛选差异性代谢物，分别为3个溶血磷脂酰胆碱（lyso-phosphatidylcholine，LPC）：LPC 18∶2 sn-1、LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2，苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）和3个磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）：PC 34∶3、PC 34∶2、PC 34∶1，见图 3，表 1、2。

2.2 毛细组治疗前后的代谢组学变化

建立OPLS-DA模型图（图 4），2组分离趋势明显，说明2组的代谢产物有明显差异；置换检验（图 5）参数显示，R²Y= 0.742，Q² =0.580，说明模型有效；提取VIP > 2且P < 0.05的变量，筛选差异性代谢物，分别为3个LPC（LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 16∶0 sn-1），Phe，PC 34∶2，SM34∶1，去甲-戊二酰胺，见图 6，表 3、4。

2.3 代谢产物的动态变化

结合上述健康儿童、RSV感染毛细支气管炎经定喘汤治疗前后的代谢产物的变化，发现LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 18∶2 sn-1、PC 34∶3、PC 34∶2、PC 34∶1、LPC 16∶0 sn-2可反映患儿从健康到发病再到治疗后好转的折线变化趋势，其中变化最明显的为LPC 18∶0 sn-1以及LPC 18∶0 sn-2，见表 5。

3 讨论

本研究对比正常组和毛细组的代谢指标，结果显示，毛细组患儿表现为LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2的升高以及LPC 18∶2 sn-1、Phe、PC 34∶3、PC 34∶2、PC 34∶1的降低，表明RSV感染后主要影响患儿的脂肪代谢。该病在中医上属外感热证范畴，研究^[10]显示，脂肪代谢与热证相关，因此患儿感染RSV后会出现脂肪代谢紊乱。LPC是氧化损伤低密度脂蛋白的主要成分，主要诱发炎症反应^[11]。PC具有乳化功能，可将胆固醇和脂肪酸化为微粒，使之排出，同时可防御病毒^[12]。研究^[13-14]发现，磷脂代谢紊乱及氨基酸代谢紊乱均为免疫功能下降，RSV感染后均有体现。

定喘汤主治痰热内蕴、肺气上逆，本研究中毛细组均予定喘汤治疗，对比其治疗前后共筛选出7个差异代谢物，包括LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 16∶0 sn-1、Phe、PC 34∶2、SM34∶1以及去甲-戊二酰胺。Phe可在肠道中分解代谢，因此RSV感染后会使肠道菌群紊乱，影响免疫功能^[15]。鞘磷脂主要可引起过敏及炎症反应，还可抑制病毒的释放。定喘汤中以桑白皮为君药，其所含的酸性物质影响血小板中环氧合酶的活性，减少炎症反应，还能增强免疫系统的调控，因此定喘汤治疗后，Phe、SM34∶1水平上升。LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 16∶0 sn-1为脂代谢的相关产物，经治疗后均明显下降，中医中认为甘草可调和脾胃，调节脂代谢紊乱，款冬花、制半夏等药物具有消炎杀菌的作用，均可达到抗病毒、增强免疫力等功效。

综上所述，RSV感染后脂代谢紊乱最为明显，LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2的水平经定喘汤治疗后变化最大，考虑与定喘汤通过改善脂代谢水平、增强抵抗力，以此促进疾病的恢复有关。本研究中代谢组学分析模型均稳定且可靠，证实选取的差异性代谢物较好。但本研究选取的样本量较小，后期需进行多中心的大样本研究，进一步验证本研究结论。