2023, Vol. 52文章信息
- 王一凡, 刘爽, 汪思齐, 李茂娟, 黄春华, 楼迪栋
- WANG Yifan, LIU Shuang, WANG Siqi, LI Maojuan, HUANG Chunhua, LOU Didong
- 急性马兜铃酸中毒小鼠肾损伤及Wnt7b/β-catenin/MMP-7的表达变化
- Renal injury and expression of Wnt7b/β-catenin/MMP-7 in mice with acute aristolochic acidosis
- 中国医科大学学报, 2023, 52(6): 505-511
- Journal of China Medical University, 2023, 52(6): 505-511
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文章历史
- 收稿日期：2022-09-30
- 网络出版时间：2023-05-25 16:12:57
引用本文 |
2. 贵州省法医中药毒理学特色重点实验室，贵阳 550000
2. Guizhou Provincial Key Laboratory of Forensic Medicine Toxicology, Guiyang 550000, China
马兜铃酸(aristolochic acids，AA) 是马兜铃科中药材的主要毒性成分，能引起肾损伤和纤维化[1]。其中AAⅠ的毒性最大[2]，摄入含有AA的中草药引起的急性或慢性肾小管间质疾病被称为AA肾病(aristolochic acid nephropathy，AAN) [3-5]。临床上对含有AA中草药的使用有严格的规范，但相关中毒事件仍有发生[6]，如未及时治疗会发展为慢性肾功能衰竭，最终形成终末期肾病[7]。
Wnt通路在机体发育、损伤修复过程中发挥着重要作用[8]。研究表明，Wnt7b能够促进肾脏发育过程中肾小管的增殖分化[9]，参与斑马鱼肾脏损伤后的再生修复[10]，但Wnt7b在哺乳动物致肾脏损害发展过程中的作用机制仍缺乏基础研究。本研究通过连续观察急性AAN不同时期和部位的肾脏病理改变及Wnt7b相关蛋白的表达变化，探讨急性AAN过程中的组织病理特征和Wnt7b通路作用机制，为明确AA的毒理机制提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 药物和试剂AAⅠ标准品(纯度96%，四川省维克奇生物科技有限公司)，溶于二甲基亚砜(北京索莱宝科技有限公司) 与0.4%羧甲基纤维素钠(上海展云化工有限公司) 中，制成2 mg/mL AAⅠ悬浊液。HE染色液(北京索莱宝科技有限公司)，免疫组化(immunohistochemistry，IHC) SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，Wnt7b兔多克隆抗体(赛默飞世尔科技中国有限公司)，β-catenin鼠多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)，基质金属蛋白酶-7 (matrix metalloproteinase-7，MMP-7) 兔多克隆抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)。
1.2 实验动物雄性KM小鼠(长沙市天勤生物技术公司) 113只，8周龄，质量(32±5) g，于贵州中医药大学实验动物中心饲养，常温环境，自由摄食、饮水。实验过程严格按照《实验动物福利伦理审查指南(GB/T358922018) 》要求执行。
1.3 动物分组及给药将113只KM小鼠于笼中适应性喂养3 d，自由进食进水。
1.3.1 生存曲线给药方式将75只小鼠随机分为5组(n = 15)，每组小鼠分别灌胃给药AAⅠ20 mg/(kg·d)、15 mg/(kg·d)、10 mg/(kg·d)、5 mg/(kg·d) 及0 mg/(kg·d) (溶剂对照)。
1.3.2 急性AAⅠ中毒模型给药方式将48只小鼠随机分为2组(n = 24)，溶剂对照组小鼠灌胃给药AAⅠ 0 mg/(kg·2 d)，模型组小鼠灌胃给药AAⅠ 5 mg/(kg·2 d)。
1.4 样本采集用药后，对照组和模型组的小鼠各随机取6只分别于第2、4、6和8天戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，颈椎脱臼处死，摘眼球取血后，用PBS和固定液全身灌注，取双侧肾组织样本，沿矢状面分为2份，PBS冲洗，一份浸入4%多聚甲醛固定，另一份用2.5%戊二醛固定。
1.5 肾功能检测将采集的血液标本1 200 r/min 4 ℃离心10 min，取上清，用mindray生化免疫流水线检测其血肌酐和尿素氮含量。
1.6 组织病理学染色将4%多聚甲醛固定的肾脏组织经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋后切片(切片厚度2~4 µm)，进行HE染色与Masson染色，光学显微镜下观察肾脏组织病理变化，并对肾小管损害指标等计数统计。
1.7 IHC染色切片样本放置于60 ℃烘箱中融蜡2 h，二甲苯脱蜡、乙醇梯度脱水。PBS冲洗后，置于100 ℃的柠檬酸缓冲液(pH6) 中，微波炉高火加热20 min，PBS浸洗。随后滴加内源性过氧化物阻断酶室温孵育，PBS浸洗。分别加入Wnt7b (1∶200)、β-catenin (1∶200) 和MMP-7 (1∶100) 3种蛋白的一抗，4 ℃冰箱孵育过夜，结束后用PBS浸洗。滴加生物素标记山羊抗小鼠/兔IgG，37 ℃孵育15 min，PBS浸洗，滴加辣根酶标记链霉素工作液，37 ℃孵育15 min，PBS浸洗。滴加DAB显色液，PBS浸洗终止染色，苏木素复染，酒精梯度脱水，二甲苯透明，封片。用ImageJ软件对IHC图像进行分析统计。
1.8 免疫电镜将组织从2.5%戊二醛固定后取出，乙醇梯度脱水，树脂渗透后进行包埋。超薄切片机切成70~80 nm超薄切片，超纯水悬浮5 min，进行复温后TBS清洗，用1%BSA封闭液室温封闭30 min，加入Wnt7b (1∶200) 和β-catenin (1∶200) 4 ℃过夜孵育，TBS清洗，加入4 nm胶体金羊抗鼠抗体(抗β-catenin) 和12 nm胶体金羊抗兔抗体(抗Wnt7b)，37 ℃烘箱孵育1 h，TBS清洗。铀复染后用70%乙醇清洗，滤纸吸干后放入网板中，透射电子显微镜下观察并采集图像。
1.9 统计学分析Masson染色和IHC的图像参考DESHPANDE等[11]的方法，采用ImageJ软件对光密度平均值进行统计，用随机区域计数法对HE图像和IHC图像计数统计。采用SPSS 24.0软件进行统计分析，数据均以x±s表示，多组间统计学差异(方差齐性检验后) 采用单因素方差分析比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 AAⅠ与小鼠生存曲线将小鼠暴露于不同浓度的AAⅠ中，AAⅠ的浓度与小鼠生存时间呈负相关。当小鼠灌胃的AAⅠ浓度为20 mg/(kg·d) 时，小鼠表现出急性毒性效应，5~8 d出现高死亡率。当AAⅠ浓度降至10 mg/(kg·d) 时，小鼠的死亡率稍降低，当AAⅠ的浓度降至5 mg/(kg·d) 时，小鼠生存率显著上升；3组生存曲线与对照组相比有统计学差异(P均 < 0.05)，见图 1。
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| *P < 0.001 vs control group. 图 1 各组生存曲线 Fig.1 Survival curves of all groups |
2.2 小鼠肾脏生化指标
血清肌酐和尿素氮检测结果显示，模型组血清肌酐在小鼠暴露于AAⅠ 6~8 d时出现显著上升，8 d时为对照组的25倍，尿素氮也随着小鼠暴露于AAⅠ的时间增加，8 d时出现统计学差异(P < 0.05)。见表 1。
| Item | Control | Acute AAⅠ poisoning model groups | |||
| 2 d | 4 d | 6 d | 8 d | ||
| Creatinine (μmol/L) | 1.60±0.36 | 3.13±0.32 | 6.50±0.53 | 21.27±6.841) | 40.63±5.651) |
| Urea nitrogen (mmol/L) | 6.19±0.42 | 7.03±0.48 | 8.85±0.44 | 12.52±2.04 | 44.93±8.621) |
| 1) P < 0.05 vs control group. | |||||
2.3 小鼠肾脏组织病理学
HE染色结果显示，小鼠肾小管损伤程度随着AAⅠ暴露时间增加而加重，肾小球无明显改变；暴露于AAⅠ 2 d后，50%以上近端小管(proximal convoluted tubule，PCT) 刷状缘破坏，伴部分上皮细胞水肿，空泡样变性；4 d时85%以上的PCTEC水肿，并出现少量坏死；6 d时坏死的PCT上皮细胞(proximal convoluted tubule epithelial cells，PCTEC) 逐渐从基底膜脱落；8 d时PCTEC坏死脱落增加，肾小管出现大量基底膜裸露，管型数量增加(P < 0.05)。皮髓交界(corticomedullary-junction，CMJ) 在暴露于AAⅠ 6~8 d时出现大量管型，远曲小管(distal convoluted tubule，DCT) 和集合管(collecting tubule，CT) 在8 d时出现少量水肿。Masson染色结果显示，AAⅠ暴露8 d后，肾皮质胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF) 较对照组显著上升，有统计学差异(P < 0.01)。见图 2、表 2。
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| Red arrows indicate the shedding of microvilli in the apical membrane of epithelial cells and the appearance of microvilli in the tubular lumen; blue arrows indicate cell edema and granular degeneration; green arrows indicate epithelial necrosis; black arrows indicate the exposed basement membrane, and asterisks indicate tubular shape. 图 2 HE和Masson染色代表性图像× 20 Fig.2 Representative images stained by HE and Masson × 20 |
| Item | Control | Acute AAⅠ poisoning model groups | |||
| 2 d | 4 d | 6 d | 8 d | ||
| Destruction of brush border of PCTEC | 0.000±0.000 | 0.520±0.0501) | 0.153±0.0211) | 0.082±0.005 | 0.091±0.0111) |
| Edema of PCTEC | 0.000±0.000 | 0.855±0.0231) | 0.440±0.0181) | 0.338±0.0851) | 0.150±0.0441) |
| Necrosis of PCTEC | 0.000±0.000 | 0.094±0.030 | 0.392±0.0471) | 0.385±0.0411) | 0.315±0.0711) |
| Basement membrane of PCT exposed | 0.000±0.000 | 0.000±0.000 | 0.016±0.006 | 0.203±0.0161) | 0.535±0.0891) |
| Distal tubule injury | 0.000±0.000 | 0.017±0.012 | 0.020±0.011 | 0.034±0.005 | 0.039±0.0201) |
| Tube cast | 0.000±0.000 | 0.538±0.0381) | 0.756±0.0601) | 0.836±0.0301) | 0.776±0.0841) |
| CVF | 0.058±0.012 | 0.077±0.036 | 0.072±0.010 | 0.098±0.025 | 0.306±0.0781) |
| 1) P < 0.01 vs control group. | |||||
2.4 小鼠肾脏Wnt7b、β-catenin和MMP-7 IHC结果
Wnt7b的IHC结果显示，模型组Wnt7b表达量上升，8 d时达到最高(主要聚集于刷状缘)；暴露于AAⅠ8 d时，PCT、CMJ和CT处的Wnt7b的IHC平均光密度值增高，PCT的表达量增高至2 d时的2.5倍(P均 < 0.05)；Wnt7b阳性的PCT比例增加，6~8 d时Wnt7b阳性小管数为70% (P均 < 0.05)。见图 3、表 3。
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| Black arrows indicate proteins stained in the renal tubular epithelial cells. The asterisk indicates proteins in the lumen. 图 3 3种蛋白近端小管免疫组化染色代表性图像× 20 Fig.3 Representative images of immunohistochemical staining of three proteins in the proximal convoluted tubules × 20 |
| Item | Control | Acute AAⅠ poisoning model groups | |||
| 2 d | 4 d | 6 d | 8 d | ||
| PCT | 0.077±0.010 | 0.091±0.004 | 0.116±0.0171) | 0.173±0.0091) | 0.197±0.0231) |
| CMJ | 0.087±0.003 | 0.077±0.018 | 0.084±0.009 | 0.145±0.0121) | 0.139±0.0151) |
| CT | 0.076±0.014 | 0.081±0.010 | 0.073±0.006 | 0.071±0.025 | 0.126±0.0291) |
| Positive renal tubules | - | 0.475±0.074 | 0.691±0.0532) | 0.735±0.0572) | 0.716±0.0242) |
| 1) P < 0.01 vs control group；2) P < 0.01 vs 2 d. | |||||
β-catenin的IHC结果显示，模型组β-catenin表达量上升(PCT的近基底膜侧)；第8天PCT、CMJ和CT处β-catenin的IHC平均光密度值和阳性小管与对照组相比明显增加，有统计学差异(P < 0.05)。见图 3、表 4。
| Item | Control | Acute AAⅠ poisoning model groups | |||
| 2 d | 4 d | 6 d | 8 d | ||
| PCT | 0.066±0.001 | 0.080±0.001 | 0.111±0.0101) | 0.124±0.0171) | 0.138±0.0141) |
| CMJ | 0.078±0.008 | 0.096±0.007 | 0.091±0.007 | 0.102±0.0121) | 0.087±0.010 |
| CT | 0.062±0.011 | 0.060±0.012 | 0.082±0.008 | 0.111±0.0141) | 0.093±0.0111) |
| Positive renal tubules | - | 0.357±0.049 | 0.471±0.0172) | 0.433±0.0222) | 0.675±0.0302) |
| 1) P < 0.01 vs control group；2) P < 0.01 vs 2 d. | |||||
MMP7的IHC结果显示，模型组MMP7在胞质内表达量上升；PCT、CMJ和CT处MMP7的IHC平均光密度值和阳性肾小管与对照组相比明显增加，有统计学差异(P < 0.05)。见图 3、表 5。
| Item | Control | Acute AAⅠ poisoning model groups | |||
| 2 d | 4 d | 6 d | 8 d | ||
| PCT | 0.051±0.001 | 0.056±0.002 | 0.053±0.008 | 0.060±0.005 | 0.089±0.0091) |
| CMJ | 0.052±0.004 | 0.122±0.0061) | 0.094±0.0171) | 0.093±0.0171) | 0.133±0.0201) |
| CT | 0.045±0.003 | 0.074±0.006 | 0.064±0.005 | 0.212±0.0221) | 0.223±0.0431) |
| Positive renal tubules | - | 0.448±0.015 | 0.551±0.042 | 0.582±0.0362) | 0.647±0.1042) |
| 1) P < 0.01 vs control group；2) P < 0.01 vs 2 d. | |||||
2.5 小鼠肾脏Wnt7b和MMP7免疫电镜结果
免疫电镜结果显示，对照组的PCTEC刷状缘绒毛排列整齐，线粒体嵴清晰，数量较多；暴露于AAⅠ 2 d后PCTEC刷状缘排列紊乱，线粒体数量减少；6 d时PCTEC空泡变性，刷状缘绒毛大量脱落，线粒体数量明显减少，呈“C”或“U”形。对照组未见Wnt7b胶体金颗粒，β-catenin胶体金颗粒主要聚集在细胞膜下；暴露于AAⅠ后，刷状缘出现成簇聚集的Wnt7b胶体金颗粒，β-catenin胶体金颗粒在细胞膜下逐渐减少，核内聚集增加。见图 4。
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| The red arrows show Wnt7b protein. The red circles represent clusters of Wnt7b protein and the black circles represent clusters of β-catenin protein. The proximal convoluted tubule epithelium was magnified 2 000 times, while the brush border, nucleus, and mitochondria were magnified 15 000 times. 图 4 Wnt7b和β-catenin免疫电镜代表性图像 Fig.4 Representative immunoelectron microscopy images of Wnt7b and β-catenin proteins |
3 讨论
AA致肾损伤事件在非洲、亚洲和欧洲均有发生[12]，而且大量不明原因慢性肾脏病被疑与含有AA的中草药有关[13]。因此，明确急性AAN早期的病理变化，阐明AAN的致病机制，对AAN的诊断和治疗有重要价值。
急性AAN的病理改变表现为肾小管受损，主要累及PCT [4]，本研究连续观察了AAN的肾小管病理学改变，结果显示，AAN以PCT损害为主，且PCTEC的损伤呈时间和AAⅠ浓度依赖性；暴露于AAⅠ后，PCTEC刷状缘绒毛脱落，线粒体形态异常，数量减少，细胞水肿、坏死、脱落。急性AAN的肾脏间质CVF增加，细胞外基质紊乱，胶原纤维增多，呈纤维化改变[14]。DCT和CT的病理改变时间较晚，以细胞水肿为主，AAⅠ主要通过分布于PCT的阴离子选择通道蛋白进入细胞[15]。
目前研究[9]已经证明Wnt4和Wnt11参与肾纤维化过程，但Wnt信号通路在急性AAN过程中的机制并不清楚。巨噬细胞所分泌的Wnt7b在组织损伤诱导的炎症过程中，参与肾小管损伤后的的修复与再生[16-19]。Wnt通路激活后β-catenin在胞质聚集并转移到核内，激活下游基因表达(如参与细胞增殖和迁移的MMP-7) [20-21]。本研究结果显示，AAⅠ可诱导Wnt7b在PCTEC的刷状缘表达，β-catenin从膜下向胞质和细胞核内聚集，核内的表达量增高，MMP-7暴露于AAⅠ后表达量也逐渐升高。在6~8 d时PCTEC大量坏死，坏死细胞中表达的Wnt7b、β-catenin和MMP-7会随着细胞碎片在肾小管内聚集，使CMJ和CT处的蛋白表达增高，可能参与诱导启动肾祖细胞的增殖修复过程[22]。本研究结果显示，AAⅠ能够激活Wnt/β-catenin信号，可能参与肾小管上皮细胞损伤后的再生与修复过程。
急性AAⅠ中毒小鼠的肾脏损害，主要以PCT上皮坏死和脱落为主，与时间和AAⅠ浓度呈正相关；DCT和CT损伤较轻，以水肿为主；PCTEC的Wnt7b、β-catenin和MMP-7的表达量增高，可能参与肾小管上皮细胞的修复和再生过程。
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