膀胱癌是常见的男性泌尿生殖系统恶性肿瘤^[1]。国际癌症研究机构2020年全球数据显示，膀胱癌新发病例数为573 278例/年，居全球男性恶性肿瘤的第6位。膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma，BLCA) 是膀胱癌的主要类型^[2]，具有局部浸润转移、易进展和复发等特点。其治疗多以手术结合放化疗为主，然而传统化疗方式容易产生较强的不良反应^[3]。近年来，随着肿瘤免疫学、肿瘤分子生物学、生物信息学等学科的迅速发展，针对肿瘤的基因诊断、基因治疗、靶向治疗已逐渐成为可能，这为膀胱癌的治疗提供了更加广阔的前景。肿瘤微环境中的免疫浸润物也在肿瘤的发生、发展以及患者结局中起关键作用。因此，肿瘤浸润免疫细胞的全面分析将阐明癌症免疫逃逸的机制，进而为开发新的治疗策略提供机会^[4]。

人滋养细胞表面糖蛋白抗原2 (trophoblast cell-surface antigen 2，Trop-2) 是由染色体1P32区域TACSTD2基因编码表达的细胞表面糖蛋白。已有研究^[5]发现，Trop-2基因高表达于多种肿瘤，如乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌和膀胱癌，可促进肿瘤细胞增殖、侵袭、转移、扩散等过程的发生。同时，其高表达往往与肿瘤患者的不良预后密切相关^[6]。近期，针对乳腺癌的靶向Trop-2的抗体偶联药物^[7]已获得批准，成为首个Trop-2上市药物。目前，Trop-2已成为开发肿瘤抗体偶联药物的新靶点，且已有部分新的抗体偶联药物是针对膀胱癌的，但Trop-2在膀胱癌发生、发展过程中的具体机制尚未明确。

本研究基于癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA) 数据库的信息，通过分析Trop-2在BLCA中的表达特点，寻找诱发该基因在BLCA中高表达的机制，发现Trop-2相关信号通路；通过cBioPortal工具找到BLCA中与Trop-2共表达基因，通过TIMER工具研究Trop-2表达与BLCA中免疫细胞浸润的关系；探讨Trop-2对BLCA预后的影响，为进一步明确BLCA的发病机制和治疗策略提供依据。

1 材料与方法 1.1 数据来源

从UCSC Xena^[8] (https://xena.ucsc.edu/) 下载TCGA-BLCA的RNA-seq数据和生存数据，提取Trop-2基因表达信息，提取年龄、性别、TNM分期、病理分期以及肿瘤的组织学分级等临床信息，最终纳入426例BLCA样本。在人类蛋白质图谱数据库(Human Protein Atlas，HPA) 中检索“TACSTD2”，选择“Tissue”和“Pathology”选项卡，获取Trop-2在正常膀胱组织和BLCA组织中的免疫组织化学染色图像资料。共获得5例正常膀胱组织和23例BLCA组织的免疫组织化学染色图像资料。

1.2 生物信息学分析工具

本研究利用R语言、GEPIA2、UALCAN、TIMER、cBioportal、HPA等在线工具对Trop-2基因进行生物信息学分析。

1.3 Trop-2表达与富集分析

利用GEPIA2工具比较Trop-2在癌组织和正常组织中的表达差异，通过HPA数据库比较Trop-2在正常膀胱组织与BLCA组织中蛋白表达的差异，利用cBioportal工具从表观遗传层面分析Trop-2异常表达的原因。基于TCGA-BLCA样本数据，利用R语言对差异基因进行富集分析，用BH法校正P值，以校正P < 0.05、|log₂FC| > 1为标准筛选出差异基因，提取上调基因，对其进行富集，分析影响肿瘤发生的潜在途径。

1.4 Trop-2共表达基因分析和肿瘤免疫浸润分析

利用cBioPortal工具进行数据挖掘，筛选与BLCA Trop-2正向共表达的基因，以FDR≤1.0E-20为标准，按Spearman相关系数r由高到低选择与Trop-2相关的显著基因，再利用TIMER工具验证Trop-2与这些基因的相关性。利用TIMER工具分析Trop-2及其共表达基因与BLCA中免疫细胞浸润的关系，r表示相关性，P < 0.05为差异有统计学意义。

1.5 Trop-2对BLCA预后影响的分析

基于TCGA-BLCA的RNA-seq数据，利用R语言提取Trop-2在不同样本中的表达量，按照中位数分为高表达和低表达，进行生存分析，比较高表达人群与低表达人群的风险比(hazard ratio，HR)，P < 0.05为差异有统计学意义。按照肿瘤的TNM分期和肿瘤组织学分级进行亚组生存分析，按照中位数分为高表达和低表达(由于肿瘤Ⅰ期的样本太少，仅对Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期进行分析；由于肿瘤组织学低级样本太少，仅对高级样本进行分析)，分析步骤同上。

2 结果 2.1 Trop-2在BLCA中的表达情况

本研究使用GEPIA2在线工具评估了Trop-2在泛癌中的表达水平，发现其在大多数癌症中呈高表达状态，包括BLCA (P < 0.05)。见图 1。

HPA数据库包含Trop-2在5例正常膀胱组织样本和23例BLCA组织样本中的免疫组织化学染色结果(抗体HPA043104、HPA055067、CAB072852)。与正常膀胱组织相比，BLCA组织中Trop-2蛋白表达(棕黄色颗粒) 数量和深度均明显高于正常膀胱组织。由此可见，Trop-2蛋白在BLCA组织中的表达显著高于正常膀胱组织。见图 2。

2.2 Trop-2的DNA甲基化水平

利用cBioPortal数据库进行DNA甲基化状态与Trop-2表达的相关性分析，明确表观遗传因素对调控Trop-2基因表达的作用。结果发现，泛肿瘤中DNA甲基化与Trop-2表达呈负相关(P < 0.05)，尤其在BLCA (r =-0.38，P = 1.40E-5)、前列腺癌(r =-0.40，P = 3.48E-20)、乳腺浸润癌(r =-0.49，P = 9.39E-42) 等肿瘤中呈显著负相关。使用UALCAN数据库进一步验证Trop-2启动子DNA甲基化状态的差异，结果发现，在BLCA、前列腺癌、浸润性乳腺癌等肿瘤中，癌组织中Trop-2甲基化比癌旁组织少，符合上述分析结果。见图 3。

2.3 Trop-2富集分析

对筛选出的1 634个高表达差异基因进行富集，结果显示，KEGG富集共19条显著通路，GO富集共279个生物学过程、69个分子生物学功能、88个细胞组分。研究发现，上调基因通过DNA结合(FDR=2.40E-8)、细胞分裂(FDR=2.90E-20)、细胞周期(FDR=5.50E-12)、病毒致癌作用(FDR=4.90E-6)、p53信号通路(FDR=3.70E-3) 等过程影响BLCA的发生。见图 4。

2.4 BLCA中Trop-2共表达基因分析和肿瘤免疫浸润分析

共有57个显著正相关基因，其中MUC20 (r=0.59，FDR=1.94E-34)、RHBDL2 (r=0.58，FDR=4.48E-34)、SPINT1 (r=0.57，FDR=9.19E-33)、GJA9 (r=0.57，FDR=1.03E-31) 与Trop-2显著正相关。见图 5。

肿瘤的发生、发展与肿瘤微环境中免疫细胞浸润、免疫修饰和免疫逃避密切相关。结果显示，Trop-2的表达水平与B细胞浸润程度呈显著正相关(r=0.13，P=0.01)，与辅助性T细胞(CD4⁺ T细胞) 呈负相关(r=-0.12，P=0.03)。与Trop-2表达正相关的7个最显著基因(FDR < 1.0E-30) 是MUC20、RHBDL2、SPINT1、GJA9、EPS8L1、ADGRF1和C1ORF116。分析这些共表达基因与浸润免疫细胞之间的关系，结果发现，MUC20 (r=0.21，P=4.17E-5)、RHBDL2 (r=0.22，P=3.59E-5)、GJA9 (r=0.21，P=8.38E-5) 与B细胞最显著相关；MUC20 (r=0.18，P=6.56E-4)、SPINT1 (r=0.16，P=2.53E-3) 与巨细胞最显著相关；SPINT1 (r=-0.20，P=1.82E-4) 与CD4⁺ T细胞最显著相关；MUC20 (r=-0.15，P=3.16E-3)、EPS8L1 (r=-0.18，P=6.15E-4) 与细胞毒性T细胞(CD8⁺ T细胞) 最显著相关。

2.5 Trop-2在BLCA中的预后分析

按Trop-2基因表达量的中位数绘制的疾病特异性生存期(disease-specific survival，DSS) 具有边际显著效应(HR=0.74，95%CI：0.52~1.05，P = 0.09)。肿瘤组织学高级，病理分期Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期亚组的DSS无显著差异。见图 6。

3 讨论

本研究应用生物信息学方法，发现Trop-2在BLCA中过表达，并与DNA甲基化呈显著负相关。通过富集分析，确认了DNA结合、细胞分裂、细胞周期、病毒致癌作用、p53信号通路等过程可能是Trop-2在BLCA中产生生物学行为的最显著途径。通过分析Trop-2及共表达基因与BLCA浸润免疫细胞的关系，发现Trop-2及多数共表达基因的表达与B细胞和巨噬细胞呈显著正相关，与CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞呈负相关，一定程度上说明了免疫过程在肿瘤发生中的作用。

2017年NERI等^[9]首次证实，DNA突变和甲基化缺失是导致癌症的一个重要原因，正常表观遗传机制的破坏即DNA甲基化，是已知的癌症发生的早期事件。Trop-2是一种与恶性肿瘤发生、侵袭和转移有关的癌基因，本研究发现其表观遗传变化在调控BLCA发育和免疫耐受中发挥重要作用。BLCA中Trop-2的表达与DNA甲基化存在显著负相关，提示Trop-2基因表达量异常升高可能是DNA甲基化水平降低的结果，通过检测Trop-2相关的DNA甲基化水平，可以早期诊断和评估BLCA。此外，在遗传层面，Trop-2的表达与DNA结合、细胞周期、病毒致癌作用、p53信号通路等生物过程相关，具有促进肿瘤细胞生长、增殖和转移的潜在作用。

肿瘤的发生是多因素、多阶段、多基因相互作用的，仅研究单基因对膀胱癌的影响是片面的。因此，探索Trop-2及其共表达基因在膀胱癌发生、发展中的作用具有非常重要的意义。本研究利用在线工具筛选出57个正向共表达基因，其中MUC20、RHBDL2、SPINT1、GJA9、EPS8L1、ADGRF1和C1ORF116等与Trop-2呈明显的共表达。同时，通过肿瘤免疫浸润分析发现，Trop-2及共表达基因与B细胞呈显著正相关，而与T细胞呈显著负相关。B细胞在一定条件下可以抵御肿瘤，主要是通过产生肿瘤特异性抗体和呈递肿瘤抗原，但某些B细胞亚群也可以抑制抗肿瘤免疫、促进肿瘤生长。2021年研究^[10]首次发现B细胞会分泌神经递质γ-氨基丁酸，进而抑制细胞毒性T细胞功能，促进肿瘤相关巨噬细胞分化，抑制抗肿瘤免疫。结合本研究的生物信息学分析结果，推测Trop-2及共表达基因可能通过B细胞抑制T细胞功能、促进肿瘤相关巨噬细胞分化，抑制抗肿瘤免疫。

已有研究^[11]表明，Trop-2基因高表达在多种癌症中具有不良预后，土耳其大学医学院研究团队回顾性分析了2013至2018年间行前列腺癌根治性切除术的101例患者的组织病理学特征，发现Trop-2在前列腺癌中表达较高且与不良预后相关，此类现象还在乳腺癌、肺癌、胃癌等肿瘤中出现。然而，本研究未能发现基于TCGA-BLCA的Trop-2表达与BLCA的生存资料有显著差异。Trop-2作为癌症驱动因子，调控BLCA发生的分子机制和组织病理通路十分复杂，针对不同种类的癌症，甚至同种类型的癌症，导致癌症发生的结果和预后不尽相同。因此，未来需要更大、更全面的样本，更深入地去探索Trop-2基因在BLCA预后中的临床意义。

Trop-2在多种实体肿瘤中高表达，已经逐渐成为开发抗体偶联药物的主要靶点。本研究同样发现了ERBB2 (酪氨酸激酶受体编码基因，又名HER2) 与Nectin-4在BCLA中为共表达基因。HER2基因变异广泛存在于许多实体肿瘤中，包括乳腺癌、胃癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌、头颈肿瘤等。目前，美国食品药品监督管理局已经批准曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、拉帕替尼、来那替尼、T-DM1用于HER2阳性乳腺癌^[12]的治疗，HER1/HER2双靶向抑制剂阿法替尼、达克替尼用于HER1敏感突变的非小细胞肺癌治疗等^[13]。此外，Nectin-4作为抗体偶联药物的潜力靶点，已于2019年12月获得美国食品药品监督管理局加速批准，用于治疗接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗期间或治疗后病情进展的局部晚期或转移性BLCA患者^[14]。近来，Trop-2抗体偶联药物也迎来了多次重大进展，其中sacituzumab govitecan-hziy已经获得批准上市^[15]。目前，以Trop-2为靶点的抗体偶联药物药物已逐步开始用于治疗膀胱癌的临床试验，其具体疗效与安全性有待临床研究证实。

尽管本研究从多角度论证了Trop-2基因在BLCA中具有重要意义，但本研究存在一些局限性：缺乏相关的实验验证，且仅利用公开数据库进行研究，缺乏亚裔人群，仍需要更大的样本量进行进一步验证。

综上所述，本研究基于生物信息学数据库的挖掘，发现Trop-2表达在BLCA组织中呈上调趋势，可能作为潜在的癌基因参与BLCA的发生、发展过程，通过参与细胞周期、病毒致癌作用、p53信号通路等生物过程调控BLCA的进展。同时，Trop-2及其多数共表达基因与B细胞和巨噬细胞呈显著正相关，与CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞呈负相关，提示Trop-2可能通过上调B细胞来抑制CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞，从而实现免疫逃逸。Trop-2作为良好的抗体偶联靶点，具有精准治疗的特性，针对Trop-2基因的抗体偶联药物临床运用的前景值得期待。