支气管哮喘(简称哮喘) 是以气道炎症、气道重塑和气道高反应性为主要病理改变的慢性气道疾病，其中气道重塑主要表现为各种结构改变所致的气道壁增厚，包括气道平滑肌细胞的炎症、肥大和(或) 增生，上皮下纤维化，杯状细胞增生，胶原沉积以及血管增多等^[1-2]。微RNA (microRNA，miRNA) 是一种小分子非编码RNA，通过与mRNA的3’非翻译区(3’-untranslated region，3’-UTR) 不完全结合，启动靶基因mRNA降解程序并抑制其翻译，在过敏性哮喘的发生、发展中起重要作用，被认为是过敏性哮喘的潜在生物标志物之一^[3]。miR-23b可通过结合不同的靶基因，参与细胞的增殖、迁移和分化以及上皮-间质转化等多种生物学过程^[4-6]。研究^[7]表明，miR-23b过表达能够促进气道平滑肌细胞的凋亡并抑制其增殖。本研究制备哮喘小鼠模型，检测miR-23b在正常和哮喘小鼠肺组织中的表达差异，获得miR-23b可能影响哮喘气道重塑的靶基因，进一步探讨miR-23b参与哮喘气道重塑的具体机制。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 主要试剂

鸡卵白蛋白，购自美国Sigma公司；原代平滑肌细胞培养体系，购自赛百慷(上海) 生物技术股份有限公司；Lipofectamine 2000，购自美国Invitrogen公司；miR-23b-5p模拟物(miR-23b-5p mimic)、抑制剂(miR-23b-5p inhibitor) 及阴性对照(miR-NC)，miRNA实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR) 引物、U6引物、反转录试剂盒，购自广州锐博生物科技有限公司；纤维连接蛋白1 (fibronectin1，FN1) 兔源多克隆抗体，购自武汉赛维尔生物科技有限公司；α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA) 兔源单克隆抗体，购自美国Abcam公司；β-actin兔源单克隆抗体，购自美国CST公司；AG RNAex Pro RNA提取试剂、SYBR Green Pro Taq HS预混型qRT-PCR试剂盒，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；Masson三色染色试剂盒和免疫组织化学显色试剂盒，购自福州迈新生物技术开发有限公司；小鼠白细胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) ELISA检测试剂盒，购自美国R & D公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒，购自美国Promega公司。

1.1.2 实验动物分组和模型制备

健康SPF级雌性BALB/c小鼠12只，6~8周龄，体质量(20±2) g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。将12只小鼠随机分为正常对照组和哮喘组，每组6只。于SPF级动物房适应性饲养1周后，哮喘组于第0、7、14天给予含Ⅴ级卵白蛋白(20 μg) 和氢氧化铝(2 mg) 的卵白蛋白致敏液0.2 mL腹腔注射，于第21天应用压缩空气式雾化器雾化2% Ⅱ级卵白蛋白激发液，3次/周，30 min/次，连续8周。正常对照组致敏和激发均给予生理盐水替代卵白蛋白。

1.1.3 细胞培养、转染和分组

人支气管平滑肌细胞(human bronchial smooth muscle cell，HBSMC) 购自美国组织培养库，接种在含10%胎牛血清、100 U/mL链霉素-青霉素的平滑肌细胞培养基中，置于37 ℃、含5%CO₂的细胞培养箱中培养。按照Lipofectamine 2000说明书，将miR-NC (miR-NC组)、miR-23b-5p模拟物(miR-23b-5p mimic组)、miR-23b-5p抑制剂(miR-23b-5p inhibitor组) 转染HBSMC。

1.2 方法

1.2.1 肺组织病理染色

取各组小鼠左侧肺组织，用4%多聚甲醛固定后，全自动脱水机脱水，石蜡包埋，制备切片，切片厚度4 μm，65 ℃烤箱中烘烤3 h后，室温保存备用。切片脱蜡至水后，使用Masson三色染色试剂盒，根据说明书，应用Masson复合染液染5 min，蒸馏水洗去染液后滴加磷钼酸，5 min后甩干。苯胺蓝染1 min，蒸馏水稍洗，滴加分化液分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察气道壁周围胶原沉积水平，应用ImageJ软件分析胶原沉着区占基底膜区面积的百分比。

1.2.2 血清细胞因子检测

应用ELISA检测血清中IL-6、TNF-α、TGF-β1、VEGF水平。操作方法参照试剂盒说明书。

1.2.3 qRT-PCR检测肺组织miR-23b-5p表达水平

提取肺组织总RNA，按说明书配置反转录反应体系。反应条件：42 ℃ 60 min；70 ℃ 10 min。使用梯度PCR仪进行反转录反应，获得cDNA并分装保存于-80℃冰箱内备用。SYBR Green Mix配置qRT-PCR反应体系，使用Roche LightCycler 480 Ⅱ型qRT-PCR仪进行两步法qRT-PCR。反应结束后，检测并确认扩增曲线和溶解曲线，记录Ct值。以U6为对照，采用Livak法进行qRT-PCR相对定量分析。

1.2.4 SP法免疫组织化学染色

石蜡切片复温后脱蜡至水，柠檬酸钠抗原修复缓冲液微波修复30 min，放凉至室温后PBS洗3次，3 min/次。擦干切片上多余水分，应用免疫组织化学试剂盒，内源性过氧化物酶阻断剂处理10 min，PBS冲洗；非特异性染色阻断剂封闭30 min，甩干；一抗FN1、α-SMA (PBS稀释，稀释比为1∶1 000) 4 ℃孵育过夜；过夜后室温下复温45 min，PBS洗去抗体，滴加辣根酶标记山羊抗兔/鼠二抗10 min，PBS冲洗；链霉亲和素-过氧化酶复合物染10 min，PBS冲洗；滴加DAB显色液后于显微镜下观察显色，自来水下冲洗10 min，苏木素复染核5 min，流水振洗，盐酸乙醇分化10 s，返蓝10 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察FN1、α-SMA在肺组织中表达分布，ImageJ软件半定量分析FN1、α-SMA平均光密度。

1.2.5 Western blotting

提取蛋白并使用BCA试剂盒定量后，加入上样缓冲液，100 ℃水浴加热5 min使蛋白质变性，-80 ℃冰箱冻存备用。PAGE蛋白凝胶电泳(120 V，60 min)，转膜(0.25 A，90 min)，快速封闭液室温封闭30 min，FN1、α-SMA、β-actin以1∶1 000稀释比稀释后4 ℃孵育过夜，TBST洗去生物膜表面抗体后，辣根酶标记山羊抗兔IgG (H+L) 以1∶5 000稀释比稀释后室温孵育1 h，ECL法检测蛋白表达，UVP系统成像，应用ImageJ软件对所得蛋白条带进行灰度值分析。

1.2.6 双荧光素酶实验检测miR-23b-5p是否靶向FN1

通过TargetScan网站(https://www.targetscan.org/vert_80/) 预测miR-23-5p与FN1 mRNA的3’-UTR存在结合位点。采用阳离子脂质体法转染细胞，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，检测双荧光素酶活性。

1.3 统计学分析

应用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。计量资料用x±s表示，组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 哮喘小鼠肺组织病理改变

Masson染色结果显示，哮喘组小鼠气道壁周围大量蓝色胶原沉积，气道平滑肌增厚、塌陷。与正常对照组相比，哮喘组小鼠气道壁周围胶原面积显著增加(P < 0.001)。见图 1。

2.2 哮喘小鼠血清中炎性细胞因子水平变化

ELISA检测结果显示，与正常对照组相比，哮喘组小鼠血清中炎性细胞因子IL-6、TNF-α、TGF-β1、VEGF表达水平显著升高(P < 0.001)。见图 2。

2.3 哮喘小鼠肺组织中miR-23b-5p表达降低

qRT-PCR结果表明，哮喘组与正常对照组小鼠肺组织中miR-23b-5p表达水平分别为0.000 4±0.000 12和0.001 0±0.000 27；与正常对照组相比，哮喘组小鼠肺组织中miR-23b-5p显著下调(P < 0.05)。

2.4 哮喘小鼠肺组织中的FN1和α-SMA表达升高

免疫组织化学染色和Western blotting结果均显示，正常对照组小鼠肺组织中可见FN1和α-SMA的表达，与正常对照组相比，哮喘组小鼠肺组织FN1和α-SMA表达显著增加(P < 0.05)。见图 3。

2.5 FN1是miR-23b-5p的直接靶点

TargetScan预测表明，FN1 3’-UTR是miR-23-5p靶向结合序列。双荧光素酶检测结果表明，与miR-NC组及miR-23b-5p inhibitor组相比，miR-23b-5p mimic组野生型FN1荧光素酶活性强度显著下调(P < 0.05)，miR-23b-5p与FN1间存在靶向作用关系。见图 4。

2.6 miR-23b-5p抑制HBSMC中FN1的表达

与miR-NC组相比，miR-23b-5p mimic组HBSMC中FN1表达水平显著下调(P < 0.05)，而miR-23b-5p inhibitor组HBSMC中FN1表达水平显著升高(P < 0.01)。见图 5。

3 讨论

气道平滑肌层增厚是哮喘患者气道壁重塑最显著的病理表现之一，与哮喘严重程度密切相关^[8]。研究^[2]表明，大多数气道重塑的特征表现会在一定程度上依赖炎症，当发生气道重塑时，气道炎症能够进一步促进气道过度狭窄，从而维持或增加气道重塑水平，而气道平滑肌的重塑改变也可以部分独立于气道炎症。本研究通过制备哮喘小鼠模型，发现在长期的卵白蛋白刺激下，哮喘小鼠的气道发生了明显的重塑性改变，主要表现为气道平滑肌增厚，气道壁周围胶原纤维沉积，血清中气道重塑相关因子IL-6、TNF-α、TGF-β1、VEGF的表达水平升高，这也与本课题组的前期研究^[9]结果一致，表明哮喘小鼠模型构建成功。

miR-23b是由染色体9q22.32区域编码的miR-23b/27b/24-1基因簇产生的一种多效性转录后调节因子，参与发育过程中正常的生长和分化、肿瘤、病毒感染、自身免疫性疾病等多种生物学过程和疾病的转录调节^[10]。miR-23b在许多免疫过程中通过调节细胞因子(如IL-17、TNF-α) 的表达，参与炎症反应的反馈调控过程^{[3, 10]}，但其在哮喘气道重塑中的作用及具体机制尚不明确。本研究结果表明，miR-23b-5p在哮喘小鼠肺组织中表达明显下调。而miR-23b-5p也被认为是影响平滑肌细胞增殖的重要因素，是支气管哮喘的潜在生物标志物和治疗靶点^[11]。miR-23b可通过结合不同的靶基因发挥其功能。本研究通过TargetScan预测到FN1可能是miR-23b-5p的靶基因，采用双荧光素酶法进一步证实了FN1是miR-23b-5p的直接靶点。纤维连接蛋白是主要的细胞外基质蛋白，调控细胞的增殖、迁移等生物学行为。研究^[12]发现FN1在哮喘患者的气道中高表达，是过敏性哮喘气道炎症和气道重塑的重要影响因素之一。本研究采用免疫组织化学染色和Western blotting半定量分析哮喘小鼠模型肺组织中FN1和α-SMA的表达水平，发现在哮喘发生时FN1和α-SMA表达升高，而过表达miR-23b-5p的气道平滑肌细胞中FN1表达降低，说明miR-23b-5p可以通过靶向抑制FN1，从而在一定程度上抑制哮喘发生时的气道重塑改变。

综上所述，miR-23b-5p在哮喘小鼠肺组织中表达下调，上调miR-23b-5p的表达能够抑制气道平滑肌的重塑改变，其机制可能与miR-23b-5p直接靶向抑制FN1的表达有关。但这一机制还有待进一步研究，以明确miR-23b-5p调控哮喘发生时气道重塑的具体机制，从而为哮喘的治疗提供新靶点。