膀胱癌（bladder cancer，BC）是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一，发病率居全世界恶性肿瘤第10位，每年新增超57万人次^[1-2]。在我国，每年新诊断BC患者约有8万例，死亡率占所有恶性肿瘤的1.1% ^[3]。临床中70%的BC为非肌层浸润性，治疗首选保留膀胱的经尿道膀胱肿物切除术，但术后易复发；30%为肌层浸润性或已发生远处转移，治疗方式除手术外多联合以顺铂为基础的全身治疗，但化疗不良反应多，患者耐受性差，且容易形成耐药^[4]。近年来随着免疫疗法和免疫检查点抑制剂在BC中的应用，一定程度上改善了患者预后，成为BC治疗中的热点。但是肿瘤组织的低免疫原性和免疫逃逸使机体难以形成持续的免疫应答，削弱了免疫治疗的效果。因此，探究BC免疫治疗的潜在分子机制有助于患者的预后判断和治疗方法的选择。

免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）作为调节性细胞死亡的一种，在具有免疫能力的宿主中激活适应性免疫，释放损伤相关的分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs），增强抗肿瘤免疫效应^[5]。最新研究^[6-7]表明在ICD诱导化疗后，肿瘤会从“冷”变“热”，从而增强免疫检查点抑制剂的疗效。因此，本研究基于ICD相关基因构建BC预后模型并预测其肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME），以期为BC的临床治疗提供依据。

1 材料与方法 1.1 数据下载和处理

通过癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）数据库（http://www.tcga.org/）下载412例BC组织和19例正常膀胱组织的转录组数据、体细胞突变数据和临床特征数据。下载数据截止日期为2022年7月24日。

1.2 ICD相关基因表达分析

检索PubMed、Embase和CNKI数据库得到的34个ICD相关基因^[8]，包括ATG5、BAX、CALR、CASP1、CASP8、CD4、CD8A、CD8B、CXCR3、EIF2AK3、ENTPD1、FOXP3、HMGB1、HSP90AA1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IFNGR1、IL10、IL17A、IL17RA、IL1B、IL1R1、IL6、LY96、MYD88、NLRP3、NT5E、P2RX7、PDIA3、PIK3CA、PRF1、TLR4和TNF。在R软件（版本3.6.2）中使用“limma”包对ICD相关基因进行两独立样本Wilcoxon秩和检验比较BC和正常膀胱组织样本间的表达差异，并用“pheatmap”包绘制ICD相关基因表达的热图。

1.3 一致性聚类识别分析

在R软件中使用“ConsensusClusterPlus”包对34个ICD相关基因进行聚类分析，评估TCGA BC队列中ICD相关的分子亚型。选择k=2对样本分型，将样本分为ICD高评分组和ICD低评分组。该过程重复1 000次以保证结果的稳定可靠。

1.4 筛选差异表达基因（differential expression gene，DEG）和功能富集分析

在R软件中使用“limma”包筛选2组ICD亚型之间的DEG。筛选标准为|logFC| > 1，调整后的P < 0.05。在R中使用“clusterProfiler”包对筛选出的DEG进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）功能富集分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

1.5 体细胞突变分析

将从TCGA数据库下载的“maf”格式体细胞突变数据，在R中使用“Maftools”包绘制瀑布图，对2组ICD亚型的突变结果进行可视化分析。

1.6 免疫浸润分析

利用ESTIMATE方法评估2组ICD亚型每个样本中Immune分数、Stromal分数和Estimate分数，即免疫组分、基质组分和总组分。利用CIBERSORT反卷积算法计算2组ICD亚型中CD8⁺T细胞、浆细胞、活化NK细胞、调节性T细胞等22种免疫细胞转录特征。R软件“limma”包对ICD高评分组和ICD低评分组的样本进行免疫检查点（PD-L1、CTLA4等）和HLA （HLA-A、HLA-B等）基因表达差异的比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

1.7 预后模型建立

利用R软件“Survival”包对34个ICD相关基因进行单因素Cox回归分析。用最小绝对值选择与收缩算子（least absolute selection and shrinkage operator，LASSO）Cox回归算法确定7个基因（P < 0.05）并建立风险预后模型。计算每例BC患者的风险评分，并将其分为高风险组和低风险组，绘制生存曲线。单因素和多因素Cox分析评估预后风险模型和临床特征对BC预后的预测价值。

2 结果 2.1 ICD相关基因在BC中的表达

本研究共纳入412例BC组织和19例正常膀胱组织，利用R软件对431例样本中34个ICD相关基因进行分析。结果显示，P2PX7、IL6、ENTPD1、LY96、CD4、NLRP3、NT5E和TLR4基因在BC组织中表达下调，而FOXP3、HMGB1、HSP90AA1、IL17RA、CASP8、MYD88、IFNB1、BAX、CALR和PDIA3在BC组织中表达上调，差异有统计学意义（P < 0.05）。绘制ICD相关基因表达的热图，见图 1。

2.2 BC中的2种ICD相关亚型

一致性聚类分析确定了2种ICD相关的分子亚型，即ICD高评分组和ICD低评分组。绘制2组的Kaplan-Meier曲线，结果发现ICD低评分组中位生存期为2.37（95%CI：1.87~3.89）个月，ICD高评分组中位生存期为5.12（95%CI：2.75~8.92）个月，log-rank检验结果显示2组的生存时间差异有统计学意义（χ²=6.9，P = 0.008），见图 2A。为了进一步探究2种ICD相关的分子亚型之间生物学功能和分子作用机制的差异，进一步比较ICD高评分组和ICD低评分组之间的DEGs。按照|logFC| > 1，调整后的P < 0.05的标准，共筛选出781个DEGs，绘制差异最明显的前30个DEG的热图，见图 2B。对这781个DEG进行GO和KEGG通路的功能富集分析，GO功能富集分析结果显示，在生物学功能上主要富集于T细胞激活、细胞活化的阳性选择、免疫球蛋白生成等过程；细胞成分的变化主要与T细胞受体复合物、主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）蛋白复合物等有关；分子功能层面主要富集于抗原结合、MHC蛋白复合物结合、免疫球蛋白受体结合等。KEGG富集分析显示这些DEG在T细胞激活、B细胞激活、T细胞活化的正向调节、免疫反应激活、T细胞增殖、免疫球蛋白生成等信号通路中显著丰富。

2.3 BC中体细胞突变分析

对ICD高评分组和ICD低评分组之间体细胞突变的差异进行分析，绘制瀑布图。结果显示，ICD高评分组的体细胞突变率为95.00%，ICD低评分组的体细胞突变率为93.92%，组间差异无统计学意义（χ²=0.16，P = 0.689）。2组中最常见的突变有TP53、TTN、KMT2D、MUC16和ARID1A等。ICD高评分组中TP53和TTN突变频率最高，分别占54%和57%，见图 3。

2.4 2种ICD相关亚型免疫浸润分析（图 4~6）

利用ESTIMATE评估ICD高评分组和ICD低评分组TME的差异。结果显示，ICD高评分组的免疫组分（Z = -12.983，P < 0.001）、间质组分（Z = -6.783，P < 0.001）和总组分（Z = -10.515，P < 0.001）均高于低风险组，而ICD高评分组的肿瘤纯度低于ICD低评分组（Z = -10.515，P < 0.001），表明ICD高评分组富含更多的免疫细胞成分，而ICD低评分组肿瘤细胞含量更高。

利用CIBERSORT反卷积算法计算2组ICD亚型中CD8⁺T细胞、浆细胞、活化NK细胞、调节性T细胞等22种免疫细胞的转录特征。结果显示，ICD高评分组中CD8⁺T细胞、激活的CD4⁺记忆T细胞、滤泡辅助性T细胞和M1型巨噬细胞的含量更高，而ICD低评分组中静止的CD4⁺记忆T细胞、激活的树突状细胞、M0型巨噬细胞、调节性T细胞的含量更高。

进一步分析免疫检查点（PD-L1、CTLA4等）和HLA（HLA-A、HLA-B等）基因在ICD高评分组和ICD低评分组之间的表达差异，结果显示，免疫检查点和HLA基因在ICD高评分组表达高于ICD低评分组。以上结果提示，ICD高评分组与免疫炎症型相关，而ICD低评分组与免疫沙漠型相关。

2.5 风险预后模型的建立

对34个ICD相关基因进行单因素Cox回归分析，结果显示，CALR、CASP8、CD8A、EIF2AK3、IFNG、IFNGR1和MYD88与BC患者的预后相关，见图 7A。利用LASSO Cox回归对这7个基因建立BC的风险预后模型，CALR、CASP8、CD8A、EIF2AK3、IFNG、IFNGR1和MYD88的系数分别为0.54，-0.12、-0.01、-0.49、-0.46、-0.28和-0.08。根据中位风险评分，将患者分为高风险组和低风险组。绘制Kaplan-Meier曲线，log-rank检验结果显示高风险组的预后比低风险组差（χ²=16.2，P < 0.001），见图 7B。对建立的预后模型和临床特征进行单因素和多因素Cox回归分析，结果显示，年龄、临床分期和风险评分是BC患者预后的独立影响因素，可以较好地预测BC患者的预后，见图 7C、7D。

3 讨论

20世纪70年代，MORALES等^[9]首次报道膀胱内灌注卡介苗可激活机体免疫系统和诱导炎症反应以发挥抗肿瘤效应。近年来，肿瘤的免疫治疗在BC治疗中取得快速发展，为局部进展和转移性BC的治疗提供了新方向^[10]。然而，免疫治疗在BC治疗中取得重大突破的同时，也面临着一些挑战和问题，如一部分BC患者对免疫治疗完全没有响应，即免疫沙漠。ICD可能发生在肿瘤治疗过程中，激活抗原特异性适应性免疫应答，将肿瘤对免疫治疗由“冷”转“热”^[11]。据此，本研究基于ICD相关基因的表达，在BC中构建了2个ICD亚型，并利用LASSO Cox回归构建了BC风险预后模型，为BC的临床治疗提供依据。

本研究分析了34个ICD相关基因在412例BC组织和19例正常组织中的表达差异。结果显示，P2PX7、IL6、ENTPD1、LY96、CD4、NLRP3、NT5E和TLR4基因在BC组织中表达下调，而FOXP3、HMGB1、HSP90AA1、IL17RA、CASP8、MYD88、IFNB1、BAX、CALR和PDIA3在BC组织中表达上调。TLR4是一种免疫调节因子，参与机体免疫应答的起始阶段，正常情况下仅表达于机体免疫细胞表面，也表达于多种恶性肿瘤细胞表面^[12]。有研究^[13-14]发现脂多糖能活化TLR4信号通路，可能参与BC细胞免疫逃逸，而苦参碱则可能通过调控TLR4抑制BC小鼠模型的肿瘤生长和诱导凋亡，提高CD4⁺/CD8⁺水平。PDIA3是一种伴侣蛋白，在多种免疫细胞中高表达，影响多种肿瘤的发生发展。有研究^[15]发现PDIA3在BC中高表达，可以作为BC诊断的生物标志物。

本研究通过聚类分析在BC中确定了2种聚类分型，即ICD低评分组和ICD高评分组。ICD低评分组和ICD高评分组间共筛选了781个DEGs，GO和KEGG通路的功能富集分析结果显示，这些DEG主要富集于免疫相关的通路以及肿瘤的发生、发展和转移等生物过程中，提示ICD低评分组和ICD高评分组间存在TME差异。ESTIMATE和CIBERSORT反卷积算法进一步发现ICD高评分组具有较高的免疫细胞浸润，免疫检查点基因和HLA基因在ICD高评分组表达更高，进一步证实了ICD高评分组具有较高的免疫细胞浸润，与免疫炎症型有关；而ICD低评分组则与免疫沙漠有关。免疫炎症型，又称为热肿瘤，表现为TME中存在大量免疫细胞浸润，对于免疫检查点抑制剂更敏感^[16]。免疫沙漠型，又称为冷肿瘤，由于缺少T细胞的激活会导致免疫耐受和免疫忽略，对免疫检查点抑制剂治疗不敏感^[17]。因此，ICD高评分组可能对免疫检查点抑制剂敏感，为免疫治疗的应用提供参考依据。

为了更好地预测BC患者的预后结局，本研究利用LASSO回归分析对CALR、CASP8、CD8A、EIF2AK3、IFNG、IFNGR1和MYD88建立风险预后模型，并通过单因素和多因素Cox回归验证该模型是BC患者的独立预后因素，具有较好的预后价值。相似地，WANG等^[18]在头颈鳞状细胞癌基于ICD相关基因的表达构建了风险预后模型，证明了该预后模型对患者预后预测的价值。

综上所述，本研究分析了ICD相关基因在BC组织中的表达情况，建立了2种ICD相关的亚型，验证了ICD亚型与BC的TME变化之间的关系，并据此构建了与ICD相关的风险预后模型，为BC患者免疫治疗的提供指导价值。