2023, Vol. 52文章信息
- 檀畅, 王喜良, 张金艳, 魏威, 邹朋书, 罗丽双, 于月新
- TAN Chang, WANG Xiliang, ZHANG Jinyan, WEI Wei, ZOU Pengshu, LUO Lishuang, YU Yuexin
- 冻融胚胎移植周期中桑葚胚移植的可行性分析
- Feasibility analysis of morula transfer in frozen-thawed embryo transfer cycle
- 中国医科大学学报, 2023, 52(4): 338-342
- Journal of China Medical University, 2023, 52(4): 338-342
-
文章历史
- 收稿日期：2022-03-10
- 网络出版时间：2023-04-12 17:01:28
引用本文 |
自1987年世界上首例试管婴儿诞生以来，辅助生殖技术不断更新完善。冻融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，FET）因其能够降低卵巢过度刺激综合征的发生，并提高单次取卵周期的胚胎利用率等优势被广泛认可[1]。胚胎质量是影响FET临床结局的重要因素。目前，卵裂期胚胎和囊胚期胚胎移植在FET周期中被广泛应用。然而，桑葚胚移植往往被忽视。
已有研究[2]表明，D5囊胚的临床妊娠率高于卵裂期胚胎，但在实际临床工作中由于患者个体差异，并不能确保D5可以得到囊胚。因此，分析D4桑葚胚在FET周期中的可行性对获得更好的临床结局至关重要。本研究回顾性分析2019年1月至2021年12月北部战区总医院生殖医学科3 557个FET周期的临床结局，进一步比较不同时间冻融胚胎以及其他影响FET结局的相关因素，为FET周期胚胎的选择提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 研究对象回顾性分析2019年1月1日至2021年12月31日于我科行FET周期的患者资料，共纳入3 557个周期。纳入标准：（1）年龄 < 45岁；（2）胚胎移植的数目1个或2个。排除标准：（1）既往卵巢手术史、生殖器畸形、子宫内膜异位症、子宫黏膜下肌瘤及宫腔粘连、输卵管积水等患者；（2）进行胚胎植入前基因检测（pre-implantation genetic testing，PGT）的患者。本研究所有入组患者内膜准备均采用激素替代周期，操作经我院医学伦理委员会审核及同意，并在患者充分知情同意情况下进行。
1.2 研究方法获卵后进行常规体外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵胞浆内单精子注射受精（intracytoplamsic sperm injection，ICSI），第1天通过观察卵母细胞是否出现双原核判断受精情况，D3挑选优质卵裂期胚胎进行冷冻，剩余胚胎经患者知情同意后进行囊胚培养，D4发育成桑葚胚，在受精后D5、D6观察并记录囊胚形成情况。
1.2.1 胚胎培养及评分本研究选择D3分裂为7~9个卵裂球、碎片率 < 10%且卵裂球均匀的优质卵裂期胚胎进行冷冻[3]。对D4发育成桑葚胚的胚胎进行冷冻，对D5评分达3BC或3CB以上的囊胚进行冷冻，若D5没有符合标准的囊胚，则继续培养至第6天，期间有达标的胚胎再冷冻。当患者无符合3BC或3CB以上标准的囊胚时，经告知并签署知情同意书后对次级胚胎进行冷冻。
1.2.2 胚胎冷冻及复苏采用玻璃化冷冻技术，冷冻前采用激光打孔法对囊胚进行人工皱缩，释放出囊胚腔的液体。复苏后的胚胎进行激光辅助孵化，囊胚为远离内细胞团的一侧透明带打穿，卵裂胚及桑葚胚为透明带削薄。复苏后的胚胎移入前1 d预平衡好的培养液，置于培养箱内培养。根据囊胚腔是否重新扩张以及解冻后桑葚胚、卵裂胚存活状态来判断胚胎的复苏情况[4]。
1.2.3 子宫内膜准备所有入组患者采用激素替代周期。从月经周期第3~5天开始口服戊酸雌二醇（补佳乐，德国拜尔）4~6 mg/d，7 d后超声监测内膜厚度和激素水平。及时调整戊酸雌二醇的用药剂量。子宫内膜厚度达到0.6 cm时，开始给予黄体酮注射液40~60 mg/d肌肉注射，进行黄体支持，内膜转化日记为第1天，至第3天移植卵裂胚，于黄体酮注射后第6天行囊胚移植，选取D5或D6囊胚复苏移植。
1.2.4 观察指标及评价标准胚胎移植后第14天检测血β-人绒毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin，β-hCG），若为阳性且移植4~5周后进行阴道B超检查，子宫内见到妊娠囊及心管搏动者即为临床妊娠，继续黄体支持至妊娠10~12周，并随访至活产。
1.3 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，组间比较应用独立样本t检验。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；用单因素分析有统计学意义数据再进行多因素logistic回归分析；应用R语言（4.1.1）绘制诺莫预测列线图。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 FET周期患者的基线资料本研究共纳入3 557例患者的基础资料，与未妊娠组相比，妊娠组年龄较小，移植日内膜较厚，差异有统计学意义（P < 0.05），体质量指数（body mass index，BMI）和不孕年限无统计学差异，见表 1。
| Item | No pregnancy group（n = 1 503） | Pregnancy group（n = 2 054） | t | P |
| Maternal age（year） | 32.95±3.61 | 32.17±3.52 | 41.85 | < 0.001 |
| BMI（kg/m2） | 23.65±3.89 | 23.76±4.04 | 0.77 | 0.381 |
| Duration of infertility（year） | 4.03±3.03 | 3.98±2.85 | 2.53 | 0.112 |
| Endometrial thickness（cm） | 1.09±3.57 | 1.04±3.36 | 28.96 | < 0.001 |
2.2 影响FET周期妊娠的单因素分析
将可能影响患者FET结局的因素进行单因素分析，结果显示，女方年龄、移植日内膜厚度、BMI、移植胚胎数目和移植胚胎类型均影响FET的临床结局，差异有统计学意义（P < 0.05），见表 2。
| Item | No pregnancy group | Pregnancy group | χ2 | P |
| Age | 39.48 | < 0.001 | ||
| ≤35 years | 995（39.0） | 1 557（61.0） | ||
| > 35 years | 508（50.5） | 497（49.5） | ||
| Endometrial thickness | 29.96 | < 0.001 | ||
| ≤0.8 cm | 334（50.8） | 323（49.2） | ||
| > 0.8-1.0 cm | 587（42.6） | 791（57.4） | ||
| > 1.0 cm | 582（38.2） | 940（61.8） | ||
| BMI | 6.27 | 0.044 | ||
| < 18.5 kg/m2 | 86（40.6） | 126（59.4） | ||
| 18.5-25.0 kg/m2 | 951（43.9） | 1 215（56.1） | ||
| > 25.0 kg/m2 | 466（39.5） | 713（60.5） | ||
| Number of embryos transferred | 5.44 | 0.011 | ||
| 1 | 800（44.2） | 1 012（55.8） | ||
| 2 | 703（40.3） | 1 042（59.7） | ||
| Type of embryo transferred | 67.31 | < 0.001 | ||
| Cleavage stage embryo | 535（46.6） | 612（53.4） | ||
| Morula | 105（43.0） | 139（57.0） | ||
| D5 blastocyst | 539（34.9） | 1 004（65.1） | ||
| D6 blastocyst | 324（52.0） | 299（48.0） |
2.3 影响FET周期妊娠的多因素分析
多因素logistic回归分析结果显示，女方年龄、移植日内膜厚度、BMI、和移植胚胎类型是FET周期妊娠的影响因素。其中，桑葚胚FET的临床结局优于D3卵裂期胚胎，差异有统计学意义（P < 0.05），见表 3。
| Item | OR（95%CI） | P |
| Age | < 0.001 | |
| ≤35 years | ||
| > 35 years | 0.69（0.59-080） | < 0.001 |
| Endometrial thickness | < 0.001 | |
| ≤0.8 cm | ||
| > 0.8-1.0 cm | 1.38（1.14-1.67） | < 0.001 |
| > 1.0 cm | 1.62（1.34-1.96） | < 0.001 |
| BMI | 0.068 | |
| < 18.5 kg/m2 | ||
| 18.5-25.0 kg/m2 | 0.82（0.61-1.10） | 0.183 |
| > 25.0 kg/m2 | 0.96（0.71-1.30） | 0.793 |
| Number of embryos transferred | < 0.001 | |
| 1 | ||
| 2 | 1.81（1.52-2.15） | < 0.001 |
| Type of embryo transferred | < 0.001 | |
| Cleavage stage embryo | ||
| Morula | 1.40（1.04-2.89） | 0.028 |
| D5 blastocyst | 2.28（1.87-2.79） | < 0.001 |
| D6 blastocyst | 0.99（0.80-1.23） | 0.934 |
2.4 移植桑葚胚作为对照的多因素分析
以D4桑葚胚为对照标准，多因素logistic回归分析结果显示，FET周期中，桑葚胚的临床结局优于D3卵裂期胚胎和D6囊胚，差异有统计学意义（P < 0.05），桑葚胚临床结局仅次于D5囊胚，差异有统计学意义（P = 0.001），见表 4。
| Type of embryo transferred morula | OR（95%CI） | P |
| Cleavage stage embryo | 0.72（0.53-0.97） | 0.028 |
| D5 blastocyst | 1.63（1.23-2.16） | 0.001 |
| D6 blastocyst | 0.71（0.52-0.96） | 0.027 |
2.5 影响FET周期结局因素的诺莫预测列线图
在FET周期中，年龄≤35岁、移植日内膜厚度 > 1.0 cm、BMI 18.5~25 kg/m2、移植2个胚胎相对容易妊娠，D5囊胚与妊娠相关性最好，桑葚胚次之，卵裂期胚胎与临床妊娠的相关性相对最差。见图 1。
|
| 图 1 影响FET周期结局因素的诺莫列线图 Fig.1 Nomograms of factors influencing the outcome of frozen-thaw embryo transfer cycle |
3 讨论
胚胎质量是影响辅助生殖技术结局的重要因素。研究[5]表明，自然生理状态下，早期胚胎在输卵管中发育，直到接近囊胚期才进入子宫腔。囊胚移植更符合自然生理现象，因此囊胚移植能提高临床妊娠率和胚胎着床率[6-8]。有研究[9-10]认为D5和D6冻融囊胚移植后的临床妊娠率无显著差异。但也有研究[11]表明，D5冻融囊胚移植的临床妊娠率明显高于D6。本研究结果显示，在FET周期中D5冻融囊胚临床结局明显优于D6囊胚和卵裂胚，差异有统计学意义。可能由于D6囊胚在发育时间上滞后1 d，发育速度慢影响其发育潜能和胚胎质量。
关于D4冻融桑葚胚移植的研究较少，胚胎的发育是一个“优胜劣汰”的选择过程，受精卵逐步卵裂发育成细胞胚、桑葚胚，直至囊胚。桑葚胚是介于卵裂胚和囊胚之间的胚胎形态，其细胞处于致密或半致密状态，发育较快的部分细胞还会形成早期囊胚，各细胞之间紧密连接形成了网状结构，构成胚胎骨架，对母体出现的一些剧烈变化具有良好抵御效果，避免出现流产等不良反应，从而提高妊娠率[12]。
研究[13]显示，即使是优质卵裂期胚胎，也有60%可能为非整倍体，而发育到桑葚胚及囊胚的胚胎非整倍体率可降低到30%左右。一方面，桑葚胚是淘汰掉发育阻滞、不融合的胚胎，形成半融合或融合的有潜力的胚胎；另一方面，桑葚胚冷冻优于囊胚冷冻，囊胚冷冻需要人工皱缩去除囊胚腔里面的大量水分，易形成冰晶从而造成胚胎损伤，而且脱水不充分影响解冻效果[14-18]。人工皱缩会增加胚胎操作和体外暴露时间，可能影响胚胎安全性，但桑葚胚不需要。此外，囊胚培养延长了胚胎在体外暴露的时间，培养环境有可能影响胚胎的发育过程，甚至造成无胚胎可用的风险。
综上所述，在FET周期中，应当充分综合考虑患者的年龄、BMI、胚胎发育状况及囊胚形成等实际情况，为每位患者量身定制移植方案，调整适宜的内膜厚度，挑选发育潜力好的胚胎移植。在患者囊胚较多的情况下，建议优先复苏D5冻融囊胚，如果D5没有形成囊胚，可以选择D6囊胚；但如果患者囊胚质量较差、没有形成囊胚或者有移植囊胚失败的经历，可以考虑D4冻融桑葚胚进行FET；本研究发现D4冻融桑葚胚与D5冻融囊胚有相近的临床妊娠概率，临床结局无统计学差异，而且明显优于D3冻融卵裂胚。因此，冻融桑葚胚进行FET是一种可行的选择，如果部分患者自身情况特殊或者无可移植D5囊胚时，将D4桑葚胚进行FET也是一种全新且可行的选择。
| [1] |
柳倩茹, 黄绮云, 池霖生, 等. 玻璃化冷冻对冻融卵裂期胚胎移植周期结局的影响[J]. 国际医药卫生导报, 2014, 20(23): 3531-3534. DOI:10.3760/cma.j.issn.1007-1245.2014.23.008 |
| [2] |
MAHESHWARI A, KALAMPOKAS T, DAVIDSON J, et al. Obstetric and perinatal outcomes in singleton pregnancies resulting from the transfer of blastocyst-stage versus cleavage-stage embryos generated through in vitro fertilization treatment: a systematic review and meta-analysis[J]. Fertil Steril, 2013, 100(6): 1615-1621. DOI:10.1016/j.fertnstert.2013.08.044 |
| [3] |
张军, 王树玉, 贾婵维, 等. 移植优质胚胎数量对临床妊娠率和多胎率的影响[J]. 生殖医学杂志, 2008, 17(3): 183-186. DOI:10.3969/j.issn.1004-3845.2008.03.006 |
| [4] |
SAKAE G, TAKASHI K, SATOMI T, et al. Prediction of pregnancy rate by blastocyst morphological score and age, based on 1, 488 single frozen-thawed blastocyst transfer cycles[J]. Fertil Steril, 2011, 95(3): 948-952. DOI:10.1016/j.fertnstert.2010.06.067 |
| [5] |
郝桂琴, 李蓉, 耿岚, 等. 胚胎移植与囊胚移植的临床结局分析[J]. 中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(31): 5739-5742. DOI:10.3969/j.issn.1673-8225.2011.31.009 |
| [6] |
THOMAS MR, SPARKS AE, RYAN GL, et al. Clinical predictors of human blastocyst formation and pregnancy after extended embryo culture and transfer[J]. Fertil Steril, 2010, 94(2): 543-548. DOI:10.1016/j.fertnstert.2009.03.051 |
| [7] |
SAKI G, RAHIM F, MORADI L. The study of developmental capacity of vitrified mouse blastocysts in different straws after transfer to mouse pseudo pregnant[J]. Pak J Biol Sci, 2008, 11(14): 1809-1814. DOI:10.3923/pjbs.2008.1809.1814 |
| [8] |
TAO J, TAMIS R, FINK K, et al. The neglected morula/compact stage embryo transfer[J]. Hum Reprod, 2002, 17(6): 1513-1518. DOI:10.1093/humrep/17.6.1513 |
| [9] |
胡毅娜, 丁涛, 赵琰. 超长方案新鲜周期D5日和D6日囊胚移植结局分析[J]. 江西医药, 2017, 52(4): 335-337. DOI:10.3969/j.issn.1006-2238.2017.04.019 |
| [10] |
EL-TOUKHY T, WHARF E, WALAVALKAR R, et al. Delayed blastocyst development does not influence the outcome of frozen-thawed transfer cycles[J]. BJOG Int J Obstet Gynaecol, 2011, 118(13): 1551-1556. DOI:10.1111/j.1471-0528.2011.03101.x |
| [11] |
SUNKARA SK, SIOZOS A, BOLTON VN, et al. The influence of delayed blastocyst formation on the outcome of frozen-thawed blastocyst transfer: a systematic review and meta-analysis[J]. Hum Reprod, 2010, 25(8): 1906-1915. DOI:10.1093/humrep/deq143 |
| [12] |
VANDERZWALMEN P, BERTIN G, DEBAUCHE C, et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification[J]. Hum Reprod, 2002, 17(3): 744-751. DOI:10.1093/humrep/17.3.744 |
| [13] |
ZHAO J, YAN Y, HUANG X, et al. Blastocoele expansion: an important parameter for predicting clinical success pregnancy after frozen-warmed blastocysts transfer[J]. Reprod Biol Endocrinol, 2019, 17(1): 15. DOI:10.1186/s12958-019-0454-2 |
| [14] |
MUKAIDA T, NAKAMURA S, TOMIYAMA T, et al. Vitrification of human blastocysts using cryoloops: clinical outcome of 223 cycles[J]. Hum Reprod, 2003, 18(2): 384-391. DOI:10.1093/humrep/deg047 |
| [15] |
MUKAIDA T, OKA C, GOTO T, et al. Artificial shrinkage of blastocoeles using either a micro-needle or a laser pulse prior to the cooling steps of vitrification improves survival rate and pregnancy outcome of vitrified human blastocysts[J]. Hum Reprod, 2006, 21(12): 3246-3252. DOI:10.1093/humrep/del285 |
| [16] |
MESUT N, CIRAY HN, MESUT A, et al. Cryopreservation of blastocysts is the most feasible strategy in good responder patients[J]. Fertil Steril, 2011, 96(5): 1121-1125. DOI:10.1016/j.fertnstert.2011.08.012 |
| [17] |
YAN W. An interview with Magdalena zernicka-goetz[J]. Biol Reprod, 2017, 96(3): 503-504. DOI:10.1093/biolre/iox003 |
| [18] |
MAHESHWARI A, HAMILTON M, BHATTACHARYA S. Should we be promoting embryo transfer at blastocyst stage?[J]. Reprod Biomed Online, 2016, 32(2): 142-146. DOI:10.1016/j.rbmo.2015.09.016 |