恶性肿瘤中肺癌的发病率和死亡率均最高，严重威胁着人类的健康。非小细胞肺癌是最常见的肺癌分型，约占肺癌的85%^[1]。近年来，虽然靶向治疗和免疫治疗的应用越来越广泛，但仍存在大量治疗不应答患者，肺癌的精准诊疗任重而道远。微RNA（microRNA，miRNA）是一类由20~24个核苷酸组成的非编码单链RNA分子，通过直接与靶基因3’非翻译区（3’-untranslated region，3’-UTR）结合，在基因转录后调控中发挥重要作用，参与多种肿瘤的发生发展^[2]。文献^[3]报道，miR-218-3p能够抑制乳腺癌间质上皮转化，参与肿瘤转移的调控。在前列腺癌症中，miR-218-3p的表达水平显著下调^[4]。此外，外泌体中miR-218-3p与结直肠癌顺铂耐药密切相关^[5]。然而，miR-218-3p在肺癌中的作用及分子机制仍知之甚少。因此，本研究通过在线数据库分析结合分子生物学实验探讨miR-218-3p在肺腺癌中的表达水平及下游靶基因，研究miR-218-3p对肺腺癌细胞增殖的影响，并进一步揭示miR-218-3p通过其靶基因信号转导与转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）对肺腺癌中免疫细胞浸润的影响，为发现肺腺癌治疗的分子标志物奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

1.1.1 细胞

人肺腺癌A549细胞系（中科院上海细胞库）。

1.1.2 试剂

RPMI1640培养基及胎牛血清（美国HyClone生物科技有限公司）、胰蛋白酶（美国HyClone生物科技有限公司）、RNA提取和PCR相关试剂（日本TaKaRa生物工程有限公司）、引物和miRNA模拟物及抑制物（上海生工生物工程股份有限公司）、STAT1和GAPDH抗体（中国BIOSS生物技术公司）、山羊抗兔和山羊抗鼠二抗（美国PROTEINTECH生物技术有限公司）、蛋白提取相关试剂（中国碧云天生物科技发展有限公司）、CCK8（南京凯基生物科技有限公司）、质粒提取试剂盒（中国天根生物技术有限公司）、荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国普洛麦格生物技术有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 RNA提取和实时PCR

应用TRIzol提取组织和细胞全RNA，按照逆转录试剂盒说明书将mRNA和miRNA逆转录为cDNA。按照TB Green Real-time PCR试剂盒说明书进行PCR，每个样本设置3个复孔，以2^-ΔΔCt法表示相对表达量，以GAPDH作为内参，目的基因与内参基因表达量的比值表示目的基因的相对表达水平。见表 1。

1.2.2 细胞转染

胰蛋白酶消化后收集A549细胞悬液，接种至6孔板后继续培养，当汇合度为70%~90%时将miR-218-3p mimics、inhibitor及阴性对照组转染A549细胞，24 h后收集各组细胞进行转染效率分析和增殖能力检测。

1.2.3 蛋白质提取和Western blotting

收集处理后各组的细胞沉淀，RIPA裂解液裂解细胞，离心后收集上清液。BCA法检测蛋白质溶液浓度后，加入蛋白上样缓冲液并混匀，100 ℃煮沸5 min使蛋白质变性。10% SDS-PAGE凝胶分离蛋白后，湿转法将蛋白转印至PVDF膜，封闭液封闭2 h后，加入STAT1/GAPDH特异性一抗孵育过夜。加入二抗后37 ℃孵育1 h，并通过ECL化学发光法检测蛋白表达水平。

1.2.4 CCK8实验检测细胞迁移能力

收集转染后各组细胞，计数5 000/mL细胞悬液接种于96孔板中继续培养。分别于24 h、48 h、72 h、96 h加入CCK8，于450 nm处检测吸光值。

1.2.5 双荧光素酶报告基因

构建包含miR-218-3p与STAT1结合位点的野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体（吉凯基因），并提取野生型、突变型和空载体双荧光素酶报告基因质粒。将指数增长期的肺腺癌细胞接种于24孔板中，分别将野生型、突变型和空载体双荧光素酶报告基因质粒与miR-218-3p mimics及正常对照（NC）共转染至肺腺癌细胞中，48 h后收集细胞，加入细胞裂解液裂解细胞，根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行荧光素酶活性检测和分析。

1.3 在线数据库

UALCAN（https://ualcan.path.uab.edu/index.html）数据库用于分析miR-218-3p在肺腺癌中的表达水平差异^[6]。Timer 2.0（shinyapps.io）用于分析STAT1表达水平与肺腺癌5年生存率的关系^[7]。

1.4 统计学分析

采用GraphPad Prism 7软件进行统计和作图，数据以x±s表示，采用配对样本t检验或独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 miR-218-3p在肺腺癌中表达下调

通过UALCAN数据库在线分析肺腺癌中差异表达的miRNA，结果显示，miR-218-3p在肺腺癌中表达水平显著降低，是潜在的抑癌基因和分子标志物，见图 1。

2.2 miR-218-3p抑制A549细胞的增殖能力

将miR-218-3p mimics、miR-218-3p inhibitor及NC转染入A549细胞后48 h，实时PCR检测结果显示，miR-218-3p mimics能够显著增加miR-218-3p表达水平，miR-218-3p inhibitor能够显著降低miR-218-3p表达水平（P < 0.05）（图 2A）。CCK8检测结果显示，miR-218-3p能够显著抑制A549细胞的增殖能力（P < 0.05）（图 2B）。

2.3 miR-218-3p靶向抑制STAT1表达

经TargetScan预测，miR-218-3p与STAT1的3’-UTR存在结合位点（图 3A）。将miR-218-3p mimics、inhibitor及NC转染入A549细胞后48 h，Western blotting检测结果显示，miR-218-3p mimics能够显著抑制STAT1蛋白表达，miR-218-3p inhibitor能够显著增加STAT1蛋白表达（P < 0.05）（图 3B）。双荧光素酶报告基因实验检测结果显示，miR-218-3p mimics能够显著抑制野生型报告基因载体活性，而不能抑制突变型报告基因载体活性（P < 0.05）（图 3C）。

2.4 STAT1表达水平与肺腺癌组织免疫细胞浸润密切相关（图 4）

UALCAN数据库在线分析结果显示，STAT1蛋白表达水平在肺腺癌中显著升高，且与增殖标志物ki-67表达水平呈正相关（图 4A、4B）。TIMER数据库在线分析结果显示，STAT1表达水平与肺腺癌组织中CD8⁺T细胞、树突状细胞和中性粒细胞的浸润程度呈正相关（图 4C）。

3 讨论

无限制的增殖能力是恶性肿瘤细胞的基本特征之一，也是判断肿瘤恶性程度的重要评价指标^[8]。细胞增殖能力受到众多炎性细胞因子的精密调控，因此发现恶性肿瘤细胞中失调的增殖相关基因至关重要。

本研究结果显示，miR-218-3p在肺腺癌中显著下调，且能够抑制肺腺癌细胞的增殖能力，提示miR-218-3p在肺腺癌的恶性进展中发挥着重要的调控作用。为进一步探讨其发挥的生物学功能和分子机制，本研究预测了miR-218-3p下游靶基因，其中包括STAT1，经验证发现miR-218-3p能够与STAT1的3’-UTR直接结合抑制STAT1蛋白表达水平。

STAT1是STATs蛋白家族成员之一，可被磷酸化激活能够发挥信号转导和转录激活双重作用，参与细胞的生长、分化、增殖及凋亡等过程的调控。STAT1在肿瘤中可通过多种不同的信号通路和调节机制发挥截然相反的作用^[9]。据文献^[10-12]报道，STAT1在包括乳腺癌、鼻咽癌及结直肠癌等众多肿瘤中发挥着癌基因的作用，促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。此外，STAT1能够通过上调炎性细胞因子，参与肿瘤的进展^[13]。本研究结果显示，在肺腺癌中STAT1表达水平与T淋巴细胞、中性粒细胞和树突状细胞的浸润呈正相关，提示STAT1在肺腺癌中不仅参与细胞增殖能力的调控，还参与肿瘤微环境的重塑及肺腺癌的发生发展。

综上所述，本研究发现miR-218-3p在肺腺癌组织中下调，且能够抑制肺腺癌细胞的增殖能力，是潜在的肿瘤抑制基因。此外，miR-218-3p能够与STAT1的3’-UTR直接结合抑制STAT1表达，参与肿瘤微环境的重塑，抑制肺腺癌的发生发展。