2023, Vol. 52文章信息
- 李盈义, 王勇, 邱冠臻, 李洪敬
- LI Yingyi, WANG Yong, QIU Guanzhen, LI Hongjing
- lncRNA H19靶向miR-194对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制
- Effect of lncRNA H19 targeting miR-194 on proliferation and invasion of osteosarcoma cells and its mechanism
- 中国医科大学学报, 2023, 52(3): 212-218
- Journal of China Medical University, 2023, 52(3): 212-218
-
文章历史
- 收稿日期：2022-07-27
- 网络出版时间：2023-03-16 16:00:54
引用本文 |
2. 沈阳医学院附属中心医院骨科，沈阳 110075;
3. 大连医科大学附属第一医院关节外科，辽宁 大连 116011
2. Department of Orthopedics, The Affiliated Central Hospital of Shenyang Medical College, Shenyang 110075, China;
3. Department of Joint Surgery, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, China
骨肉瘤来源于成骨间充质细胞，是儿童和青少年最常见的原发性恶性骨肿瘤，每年总发病率约4.4/100万[1]。骨肉瘤具有高侵袭性，在发病初期就有较高的转移率[2]。未发生转移的骨肉瘤患者5年生存率约为70%，而转移或复发患者的总体生存率 < 20%[3]。因此，明确骨肉瘤发生发展的分子机制意义重大。
长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是长度 > 200个核苷酸的非编码RNA，可以调控多种基因的表达。研究[4]表明，lncRNA在骨肉瘤临床标本和细胞系中异常表达，在骨肉瘤的发生发展过程中起着核心作用。人类lncRNA H19基因位于11P15.5染色体，在众多肿瘤的发生发展中发挥作用[5]。研究[6-7]显示骨肉瘤组织和血清外泌体中lncRNA H19表达升高，且lncRNA H19表达与肺转移、Enneking肿瘤分期及患者预后密切相关。然而，lncRNA H19在骨肉瘤细胞发展过程中的作用机制尚不清楚。研究[8]显示，在胆囊癌中，lncRNA H19表达升高，微RNA 194（microRNA 194，miR-194）表达降低，抑制lncRNA H19表达，能够抑制胆囊癌细胞的增殖，上调miR-194的表达，在此基础上抑制miR-194的表达能够逆转这种效应。本研究探讨lncRNA H19靶向miR-194对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的影响及其作用机制，旨在为明确骨肉瘤新的分子标志物奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料来源收集2018年1月至2019年6月于大连医科大学附属大连市第五人民医院骨外二科行骨肉瘤切除术患者的骨肉瘤组织及对应癌旁组织标本各30例。患者术前均常规取肿瘤组织做病理检查，病理证实为骨肉瘤，并常规接受化疗，待肿瘤周围水肿带消失行扩大切除手术。切除的肿瘤组织和癌旁组织在离体后用生理盐水洗净，放入液氮中并移至-80 ℃冰箱中保存。待病理结果证实为骨肉瘤和正常组织后进行后续实验。本研究获得医院伦理委员会批准，患者均知情同意并签署知情同意书。
人正常成骨细胞hFOB1.19和骨肉瘤细胞SAOS-2、U2OS购于美国ATCC公司，DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、LipofectamineTM2000和Trizol试剂购于美国Invitrogen公司，G-418和MTT试剂盒购于北京索莱宝公司，Transwell小室和Matrigel基质胶购于美国康宁公司，PCR引物、lncRNA H19小干扰RNA（si-H19）、RNA干扰无意义序列（si-NC）、miR-194模拟物（miR-194 mimics）、miRNA阴性对照（miR-NC）、miR-194干扰序列（anti-miR-194）、空载体（pcDNA3.1）、H19过表达载体（pcDNA3.1-H19）、野生型荧光素酶报告基因载体（WT-H19）、突变型荧光素酶报告基因载体（MUT-H19）购于上海生工生物有限公司，荧光素酶活性检测试剂盒购于北京Promega公司，PVDF膜购于中国碧云天公司，N-钙黏蛋白（cadherin 2，CDH2）、胰岛素样生长因子1受体（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）、GAPDH抗体、山羊抗兔IgG购于美国Santa公司，实时定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒购于日本TaKaRa公司。
1.2 细胞培养采用含10% 胎牛血清的DMEM培养基（青链霉素双抗含量为1%）分别培养SAOS-2和U2OS细胞，采用含10% 胎牛血清的DMEM/F12培养基（G418含量为0.3 mg/mL）培养hFOB1.19细胞，置于37 ℃、5% CO2的培养箱，细胞密度达80%左右进行传代培养。
1.3 细胞转染取处于对数生长期的人骨肉瘤SAOS-2细胞（约2×105个）接种到6孔板，细胞融合度达60% 左右时利用脂质体LipofectamineTM2000进行转染，实验设置lncRNA H19小干扰RNA组（si-H19组）、RNA干扰无意义序列组（si-NC组）、miR-194模拟物组（miR-194 mimics组）、miRNA阴性对照组（miR-NC组），转染48 h后收集细胞，qRT-PCR检测转染效率并用于后续实验。
为验证lncRNA H19是否通过调控miR-194的表达影响骨肉瘤细胞增殖和侵袭，将anti-miR-NC、anti-miR-194分别与si-H19共转染至SAOS-2细胞，分为si-H19+anti-miR-NC组、si-H19+ anti-miR-194组，转染48 h后收集细胞，qRT-PCR检测转染效率并用于后续实验。
1.4 qRT-PCR检测H19和miR-194的表达采用Trizol试剂盒提取组织与细胞总RNA，测定浓度和纯度后逆转录成cDNA进行qRT-PCR，测定miR-194和H19表达水平，分别以U6和GAPDH作为内参，2-ΔΔCt法计算相对表达量，引物序列：H19，F，5’-TGAGCTCTCAGGAGGGAGGAT GG-3’；R，5’- TTGTCACGTCCACCGGACCTG-3’。miR-194，F，5’- ATGGACCTGGGGCCAGCGAAG -3；R，5’-TCTGGCCTGGGAGCGTCG-3’。GAPDH，F，5’- TGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3’；R，5’- TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3’。U6，F，5’- CTCGCTTCGGCACA-3’；R，5’- AACGCTTCACGAATTTGCGT -3’。
1.5 MTT检测细胞活力取5×103个SAOS-2细胞接种于96孔板，实验设置si-H19组、si-NC组、miR-194 mimics组、miR-NC组、si-H19+anti-miR-NC组以及si-H19+ anti-miR-194组，转染后，37 ℃，5% CO2条件下培养，在培养24、48、72 h时各组每孔加MTT溶液（20 μL），继续培养4 h后弃去孔内液体，加入DMSO液（150 μL），振荡混匀后酶标仪测定570 nm处吸光度（optical density，OD）值。
1.6 Transwell实验检测细胞侵袭能力将基质胶以1∶8稀释后包被于Transwell小室上室，4 ℃凝固。将转染后的si-H19组、si-NC组、miR-194 mimics组、miR-NC组、si-H19+anti-miR-NC组以及si-H19+ anti-miR-194组SAOS-2细胞消化处理后，将细胞密度调整为1×105/mL，在小室上层和下室分别加入100、500 μL含10% 胎牛血清的培养液，孵箱中继续培养24 h，取出后擦去未穿膜细胞，固定，结晶紫染色20 min后置于显微镜下观察、计数和拍照。
1.7 双荧光素酶报告基因实验应用生物信息学StarBase数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/）分析miR-194是否为lncRNA H19的靶基因，设计合成野生型（pGL3-H19-WT）与突变型（pGL3-H19-MUT）的pGL3表达载体，将pGL3-H19-WT和pGL3-H19-MUT同miR-194 mimics或miR-NC共转染SAOS-2细胞，培养48 h后检测双荧光素酶活性，验证二者的靶向关系。
1.8 Western blotting收集si-H19组、si-NC组、miR-194 mimics组、miR-NC组、si-H19+anti-miR-NC组以及si-H19+ anti-miR-194组SAOS-2细胞并提取细胞的总蛋白，使用BCA试剂盒检测蛋白浓度，取蛋白样品（30 μg）与上样缓冲液充分混合变性后上样，SDS-PAGE凝胶电泳结束后进行转膜、封闭、洗膜、一抗4 ℃孵育（稀释比例：CDH2、IGF1R为1∶1 000，GAPDH为1∶2 500），洗膜、二抗孵育（稀释比例为1∶2 000）、洗膜、化学发光、采集图像，以GAPDH作为内参进行灰度值分析。
1.9 统计学分析应用SPSS 20.0进行数据分析，计量资料以x±s表示，2组比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 lncRNA H19和miR-194在骨肉瘤组织和细胞系hFOB1.19、SAOS-2、U2OS中的表达与癌旁组织比较，骨肉瘤组织中lncRNA H19表达水平升高（P < 0.05），miR-194表达水平降低（P < 0.05），见图 1A、1B。与人正常成骨细胞hFOB1.19比较，骨肉瘤细胞SAOS-2、U2OS中lncRNA H19表达水平升高，miR-194表达水平降低（P < 0.05），见图 1C。
|
| A，the expression of lncRNA H19 in cancer and adjacent tissues；B，the expression of miR-194 in cancer and adjacent tissues；C，the expression of H19 and miR-194 in cell lines. * P < 0.05. 图 1 lncRNA H19和miR-194在骨肉瘤组织和细胞系中的表达 Fig.1 Expressions of lncRNA H19 and miR-194 in osteosarcoma tissues and cell lines |
2.2 qRT-PCR检测转染效率
各组SAOS-2细胞转染后应用qRT-PCR检测转染后lncRNA H19和miR-194的表达。结果显示，转染si-H19后，lncRNA H19的表达下降；转染miR-194模拟物后，miR-194表达升高（P < 0.05），表明si-H19和miR-194模拟物转染成功。见图 2。
|
| A，the transfection efficiency of si-H19 group；B，the transfection efficiency of miR-194 mimics group. * P < 0.05 vs si-NC or miR-NC group. 图 2 qRT-PCR检测各组转染效率 Fig.2 Transfection efficiency in each group determined using qRT-PCR |
2.3 抑制lncRNA H19对SAOS-2细胞增殖和侵袭的影响
MTT结果显示，与si-NC组比较，si-H19组细胞的增殖能力下降（P < 0.05，图 3A）；Transwell侵袭实验结果显示，与si-NC组比较，si-H19组细胞的侵袭能力下降（P < 0.05，图 3B）。提示沉默lncRNA H19能够抑制骨肉瘤SAOS-2细胞的增殖和侵袭能力。
|
| A，cell viability was detected by MTT；B，cell invasion capability was detected by Transwell（crystal violet staining ×200）. * P < 0.05 vs si-NC group. 图 3 抑制lncRNA H19对SAOS-2细胞增殖和侵袭的影响 Fig.3 Effect of inhibiting lncRNA H19 on the proliferation and invasion of SAOS-2 cells |
2.4 过表达miR-194对SAOS-2细胞增殖和侵袭的影响
结果显示，与miR-NC组比较，miR-194 mimics组细胞的增殖能力下降（P < 0.05，图 4A）；Transwell侵袭实验结果显示，与miR-NC组比较，miR-194 mimics组细胞的侵袭能力下降（P < 0.05，图 4B）。提示过表达miR-194能够抑制骨肉瘤SAOS-2细胞的增殖能力和侵袭能力。
|
| A，cell viability was detected by MTT；B，cell invasion capability was detected by Transwell（crystal violet staining×200）. * P < 0.05 vs miR-NC group. 图 4 过表达miR-194对SAOS-2细胞增殖和侵袭的影响 Fig.4 Effects of overexpression of miR-194 on the proliferation and invasion of SAOS-2 cells |
2.5 lncRNA H19靶向调控miR-194的表达（图 5）
|
| A，the binding site of miR-194 in H19；B，the relative luciferase activity was detected in SAOS-2 cells；C，effect of overexpression of H19 on the expression of miR-194；D，effect of interfering H19 on the expression of miR-194. * P < 0.05 vs miR-NC or si-NC group. 图 5 lncRNA H19靶向调控miR-194的表达 Fig.5 lncRNA H19 regulates the expression of miR-194 |
Starbase 2.0网站在线预测结果显示，H19可以与miR-194结合（图 5A）。双荧光素酶实验结果显示，与pGL3-H19-WT/miR-194 NC组比较，pGL3-H19-WT/miR-194 mimics组细胞的荧光素酶活性下降（P < 0.05）；与pGL3-H19-MUT/miR-194 NC组比较，pGL3-H19-MUT/miR-194 mimics组细胞的荧光素酶活性无明显变化（P > 0.05），见图 5B。与pcDNA-3.1组比较，pcDNA-H19组细胞miR-194的表达水平显著降低（P < 0.05，图 5C）；与si-NC组比较，si-H19组细胞miR-194的表达水平升高（P < 0.05），见图 5D。提示H19可以靶向负调控miR-194的表达。
2.6 干扰miR-194表达逆转了抑制H19表达对骨肉瘤SAOS-2细胞增殖和侵袭的影响与si-NC组比较，si-H19组SAOS-2细胞miR-194的表达水平升高，细胞活力显著降低，侵袭细胞数目减少，CDH2、IGF1R蛋白的表达水平降低（P < 0.05）。与si-H19+ anti-miR-NC组比较，si-H19 + anti-miR-194组SAOS-2细胞miR-194的表达水平降低，细胞活力显著升高，细胞侵袭数目升高，CDH2、IGF1R蛋白的表达水平升高（P < 0.05），见图 6。提示干扰miR-194表达逆转了抑制lncRNA H19表达对骨肉瘤SAOS-2细胞增殖和侵袭的影响。
|
| A，effect of interference H19，miR-194 on proliferation and invasion-related protein expression；B，expression of miR-194 in si-H19+anti-miR-194 group；C，cell viability was detected by MTT；D，expression of CDH2 and IGF1R in si-H19+anti-miR-194 group. * P < 0.05 vs si-H19+anti-miR-NC group. 图 6 干扰miR-194表达逆转了抑制H19表达对骨肉瘤SAOS-2细胞增殖和侵袭的影响 Fig.6 Interference with miR-194 expression reverses the effect of inhibiting H19 expression on the proliferation and invasion of osteosarcoma SAOS-2 cells |
3 讨论
骨肉瘤的发病机制复杂，有众多信号通路参与其中，lncRNA在这些信号通路中起着至关重要的作用[9-10]。lncRNA H19是一种印迹基因，rs217727多态性在骨肉瘤风险的遗传易感性中发挥重要作用[11]。在骨肉瘤MG63细胞系中，lncRNA H19表达升高，抑制H19的表达可以抑制细胞的增殖和侵袭能力，但具体机制尚不清楚[12]。骨肉瘤组织中H19也高表达，表达水平与骨肉瘤的转移和侵袭正相关，NF-κB信号通路可能参与其中[13]。本研究采用qRT-PCR检测骨肉瘤组织和细胞系中lncRNA H19的表达水平。结果显示，H19在骨肉瘤组织和细胞系中表达水平明显升高，与以往研究结果一致。提示H19的表达异常可能参与骨肉瘤的发展，进一步将lncRNA H19干扰序列转染SAOS-2细胞，发现siRNA下调H19表达后，抑制了SAOS-2细胞增殖能力和侵袭能力，表明H19在SAOS-2细胞中可能发挥癌基因的作用。
有研究[14]显示，lncRNA H19可以通过竞争性内源性RNA活性，结合靶向miRNA反应元件，调控下游基因表达，在骨肉瘤发生过程中发挥作用。本研究发现H19通过调节miR-194在骨肉瘤中发挥作用。应用qRT-PCR检测骨肉瘤组织和细胞系中miR-194的表达水平，结果显示，miR-194在骨肉瘤组织和细胞系中表达水平明显下降，与骨肉瘤中H19的表达趋势相反；同时，转染si-H19可以负向影响SAOS-2细胞中miR-194的表达。进一步通过Starbase 2.0网站在线预测，结果发现H19与miR-194存在结合位点，双荧光素酶报告基因实验进一步提示H19可以靶向负调控miR-194的表达。将miR-194模拟物转染SAOS-2细胞，发现miR-194过表达后，抑制了SAOS-2细胞增殖能力和侵袭能力。miR-194被认为是肿瘤抑制因子，骨肉瘤患者组织和血清中miR-194表达水平降低，与临床分期、组织浸润、转移和不良预后密切相关[15-16]，骨肉瘤细胞SOSP-9607中过表达miR-194能够抑制肿瘤细胞的转移能力[17]，与本研究结果一致。
CDH2被认为是肿瘤侵袭、恶性状态的标志物。在某些上皮性癌中，细胞通过上调CDH2获得运动性和侵袭性[18]。IGF1R是一种跨膜酪氨酸激酶，肿瘤中通常过度表达，在肿瘤细胞增殖过程发挥作用[19]。研究[20-21]显示，骨肉瘤中CDH2和IGF1R是miR-194的靶基因，它们的表达受到miR-194的负向调控，影响骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。本研究结果显示，si-H19组SAOS-2细胞miR-194的表达水平升高，细胞活力显著降低，侵袭细胞数目减少，CDH2和IGF1R蛋白的表达水平降低；在干扰H19表达的基础上同时干扰miR-194表达，SAOS-2细胞中miR-194的表达水平降低，细胞活力显著升高，细胞侵袭数目升高，CDH2和IGF1R蛋白的表达水平升高。表明在干扰H19表达的基础上干扰miR-194表达，可以逆转抑制H19表达对骨肉瘤SAOS-2细胞增殖和侵袭的影响，机制可能与影响CDH2和IGF1R的表达有关。
综上所述，骨肉瘤组织和细胞系中lncRNA H19的表达升高，骨肉瘤组织和细胞系中miR-194的表达下降，沉默骨肉瘤细胞SAOS-2中lncRNA H19的表达，可以抑制细胞的增殖和侵袭，其机制可能与上调SAOS-2细胞中miR-194表达，进一步下调CDH2和IGF1R的表达有关。
| [1] |
EATON BR, SCHWARZ R, VATNER R, et al. Osteosarcoma[J]. Pediatr Blood Cancer, 2021, 68(S2): 28352. DOI:10.1002/pbc.28352 |
| [2] |
MILLER BJ, CRAM P, LYNCH CF, et al. Risk factors for metastatic disease at presentation with osteosarcoma: an analysis of the SEER database[J]. J Bone Joint Surg Am, 2013, 95(13): e89. DOI:10.2106/JBJS.L.01189 |
| [3] |
HARRISON DJ, GELLER DS, GILL JD, et al. Current and future therapeutic approaches for osteosarcoma[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2018, 18(1): 39-50. DOI:10.1080/14737140.2018.1413939 |
| [4] |
GHAFOURI-FARD S, SHIRVANI-FARSANI Z, HUSSEN BM, et al. The critical roles of lncRNAs in the development of osteosarcoma[J]. Biomed Pharmacother, 2021, 135: 111217. DOI:10.1016/j.biopha.2021.111217 |
| [5] |
邹瑞, 林颖, 欧阳可雄, 等. H19基因在肿瘤发生发展中的作用研究进展[J]. 实用医学杂志, 2015, 31(19): 3256-3258. DOI:10.3969/j.issn.1006-5725.2015.19.046 |
| [6] |
李勇, 高书明, 刘广飞, 等. H19基因在骨肉瘤中的表达及其对预后的影响[J]. 川北医学院学报, 2019, 34(2): 187-189, 193. DOI:10.3969/j.issn.1005-3697.2019.02.06 |
| [7] |
杨彪, 魏新锁, 赵晓光, 等. 血清外泌体源性长链非编码RNA H19在骨肉瘤中的表达及其临床意义[J]. 临床检验杂志, 2020, 38(12): 899-902. DOI:10.13602/j.cnki.jcls.2020.12.05 |
| [8] |
Wang SH, Wu XC, Zhang MD, et al. Long noncoding RNA H19 contributes to gallbladder cancer cell proliferation by modulated miR-194-5p targeting AKT2[J]. Tumour Biol, 2016, 37(7): 9721-9730. DOI:10.1007/s13277-016-4852-1 |
| [9] |
王召凯, 李苗, 戚勋, 等. 长链非编码RNA在骨肉瘤领域的研究进展[J]. 解剖科学进展, 2021, 27(3): 371-373, 377. DOI:10.16695/j.cnki.1006-2947.2021.03.029 |
| [10] |
HAN JM, SHEN XH. Long noncoding RNAs in osteosarcoma via various signaling pathways[J]. J Clin Lab Anal, 2020, 34(6): e23317. DOI:10.1002/jcla.23317 |
| [11] |
He TD, Xu D, Sui T, et al. Association between H19 polymorphisms and osteosarcoma risk[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2017, 21(17): 3775-3780. |
| [12] |
吴磊, 惠慧, 刘鹏, 等. 沉默H19对骨肉瘤细胞系MG63增殖、侵袭的影响[J]. 现代肿瘤医学, 2016, 24(15): 2366-2368. DOI:10.3969/j.issn.1672-4992.2016.15.008 |
| [13] |
ZHAO J, MA ST. Downregulation of lncRNA H19 inhibits migration and invasion of human osteosarcoma through the NF-κB pathway[J]. Mol Med Rep, 2018, 17(5): 7388-7394. DOI:10.3892/mmr.2018.8746 |
| [14] |
LI M, CHEN HW, ZHAO YJ, et al. H19 functions as a ceRNA in promoting metastasis through decreasing miR-200s activity in osteosarcoma[J]. DNA Cell Biol, 2016, 35(5): 235-240. DOI:10.1089/dna.2015.3171 |
| [15] |
汪勇刚. 骨肉瘤中miR-194的表达水平及其与临床病理参数的关系[J]. 临床骨科杂志, 2020, 23(2): 280-283. DOI:10.3969/j.issn.1008-0287.2020.02.050 |
| [16] |
SHI L, XIE CJ, ZHU JF, et al. Downregulation of serum miR-194 predicts poor prognosis in osteosarcoma patients[J]. Ann Diagn Pathol, 2020, 46: 151488. DOI:10.1016/j.anndiagpath.2020.151488 |
| [17] |
白马恒, 韩康, 周勇, 等. miRNA-194对人骨肉瘤细胞系SOSP-9607转移的作用研究[J]. 现代生物医学进展, 2016, 16(23): 4423-4426, 4405. DOI:10.13241/j.cnki.pmb.2016.23.006 |
| [18] |
LI G, SATYAMOORTHY K, HERLYN M. N-cadherin-mediated intercellular interactions promote survival and migration of melanoma cells[J]. Cancer Res, 2001, 61(9): 3819-3825. |
| [19] |
RIEDEMANN J, MACAULAY VM. IGF1R signalling and its inhibition[J]. Endocr Relat Cancer, 2006, 13(Suppl 1): S33-S43. DOI:10.1677/erc.1.01280 |
| [20] |
HAN K, ZHAO TB, CHEN X, et al. MicroRNA-194 suppresses osteosarcoma cell proliferation and metastasis in vitro and in vivo by targeting CDH2 and IGF1R[J]. Int J Oncol, 2014, 45(4): 1437-1449. DOI:10.3892/ijo.2014.2571 |
| [21] |
MIAO JL, WANG WG, WU S, et al. MiR-194 suppresses prolifera- tion and migration and promotes apoptosis of osteosarcoma cells by targeting CDH2[J]. Cell Physiol Biochem, 2018, 45(5): 1966-1974. DOI:10.1159/000487973 |