2023, Vol. 52文章信息
- 张鹤, 赵晓宇, 郑锐, 何忠
- ZHANG He, ZHAO Xiaoyu, ZHENG Rui, HE Zhong
- Src酪氨酸激酶抑制剂对表皮生长因子诱导的肺腺癌细胞生长的作用及机制
- Mechanism of Src tyrosine kinase inhibitor suppresses the growth of lung adenocarcinoma cells induced by epidermal growth factor
- 中国医科大学学报, 2023, 52(2): 132-136
- Journal of China Medical University, 2023, 52(2): 132-136
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文章历史
- 收稿日期：2022-09-30
- 网络出版时间：2023-01-31 13:09:44
引用本文 |
肺癌是全世界最常见的死亡原因之一，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC) 约占肺癌的85%[1-2]。肺癌患者确诊时多为晚期，不适合进行手术治疗。绝大多数的肺癌对传统的放化疗也不敏感，肺癌患者的5年生存率一直较低[3-4]。因此发现更多的肺癌靶向基因及信号传导通路，并进行相应的分子靶向治疗，对提高肺癌的治疗效果有极其重要的意义。
生长因子受体，特别是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR) 在肿瘤的生长转移过程中起着重要作用。EGFR突变(外显子19缺失，外显子18变异，外显子21L858R替换) 在NSCLC中被发现与肿瘤的增殖转移有关[5]，在临床应用过程及实验室试验均有不同EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI) 耐药的报道[6]，寻找新的靶向治疗药物十分必要。
Src是非受体酪氨酸激酶，参与包括乳腺癌、肺腺癌、和结肠癌在内多种肿瘤的生长转移[7]。在NSCLC细胞中，Src过度活化，其活化程度与肿瘤体积相关。虽然EGFR多是由配体连接或是胞质尾区自磷酸化活化，但也有研究[7]证实Src作为EGFR通道下游因子，可以通过磷酸化Y845激活EGFR信号通路。Src酪氨酸激酶抑制剂(Src-tyrosine kinase inhibitor，Src-TKI) 也作为新的靶向治疗药物用于抑制肿瘤细胞增殖浸润。
已有研究[8]证实，Src-TKI在体内和体外均可抑制肺腺癌细胞的生长、增殖和转移。然而，Src-TKI的作用机制并不十分清楚。本研究旨在探讨Src-TKI对表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF) 诱导的肺腺癌细胞生长转移抑制作用及其机制。
1 材料与方法 1.1 细胞培养肺腺癌PC-9和A549细胞，由曾根三郎教授(日本德岛大学) 赠送。PC-9和A549细胞置于含10%小牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养。
1.2 主要试剂选择性Src酪氨酸激酶抑制剂4-苯胺喹唑啉衍生物由英国AstraZeneca公司提供。抗Src抗体和抗Src [pY418]磷酸化抗体购自美国Biosoure International公司，抗EGFR抗体、抗MAPK抗体购自美国Cell Signaling公司。
1.3 细胞侵袭实验采用改良的Boyden-chamber法检测肺癌细胞体外浸润。使用胶原Ⅰ (30 μg/filter) 包埋孔径为8 μm的transwell小室。血清饥饿24 h的肺癌细胞(1×105/200 μL) 悬浮于含有不同浓度Src-TKI和/或EGF的培养液中，将PC-9和A549根据加入EGF和Src-TKI浓度各分成6组，其中PC-9分为不加EGF组：Src-TKI浓度0 μmol/L记为A1组，浓度0.1 μmol/L记为B1组，浓度1.0 μmol/L组记为C1组；加入EGF组：Src-TKI浓度0 μmol/L记为D1组，浓度0.1 μmol/L记为E1组，浓度1.0 μmol/L组记为F1组。A549分为不加EGF组：Src-TKI浓度0 μmol/L记为A2组，浓度1.0 μmol/L记为B2组，浓度3.0 μmol/L记为C2组；加入EGF 10 ng/mL组：浓度0 μmol/L记为D2组，浓度1.0 μmol/L记为E2组，浓度3.0 μmol/L记为F2组。加至槽的上层，含有10 μg/mL纤维联结蛋白的趋化液加至槽的下层。将肺癌细胞置37 ℃、5%CO2培养箱中孵育6 h后，用棉棒擦掉未浸润到下层的细胞，切下分隔膜，使用Diff-Quik系统进行固定和染色。在200倍亮视野显微镜下随机选取6个视野计数细胞数，取3个独立实验的平均值进行统计学分析。
1.4 细胞活力实验台盼蓝拒染实验用于验证细胞活力。PC-9和A549细胞接种于24孔板，置于37 ℃，5%CO2培养箱中孵育24 h，然后加入不同浓度的Src-TKI和(或) EGF，具体分组见1.3。孵育6 h后收集细胞，利用台盼蓝染色，在亮视野显微镜下计数。
1.5 细胞增殖实验利用MTT实验检验细胞增殖情况。将PC-9和A549细胞(2×103/100 μL) 接种于96孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24 h，每孔加入不同浓度的Src-TKI和/或EGF，将PC-9和A549根据加入EGF和Src-TKI浓度分组，不加EGF组Src-TKI浓度分别为0 μmol/L、0.1 μmol/L、0.3 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L，加入EGF 10 ng/mL组Src-TKI浓度分别为0 μmol/L、0.1μmol/L、0.3 μmol/L、1.0 μmol/L和3.0 μmol/L，设置细胞对照及空白对照，每组样本设6个复孔，置于37 ℃、5% CO2培养箱孵育72 h后，每孔加入50 μLMTT (2 mg/mL)，继续培养2 h，去掉含MTT的培养液，加入100 μL DMSO，充分振荡溶解深蓝色结晶，于MTP-120微孔板酶免比色仪下测定吸光度值，550 nm和630 nm分别为检测和参考波长。最终计算3次实验的平均值。
1.6 Western blottingWestern blotting实验用于验证Src表达和Src-TKI对Src磷酸化及其下游信号磷酸化的影响。将PC-9和A549细胞接种于6孔板上，给予不同浓度的Src-TKI和/或EGF处理60 min (为检测所有酪氨酸激酶磷酸化情况，PC-9细胞加入10 ng/mL EGF和/或1 µmol/L Src-TKI处理30 min)，PBS洗涤2次，加入细胞裂解缓冲液，于干冰上速冻。收集裂解液，低温超声粉碎，离心20 min (14 000 r/min，0 ℃)，采用Bradford蛋白分析试剂测量所提取蛋白的浓度。细胞裂解液在SDS-PAGE分离，蛋白转移至硝酸纤维膜，加入5%BSA室温封闭1 h，加入特异性抗体4 ℃过夜，然后加入二抗室温下处理1 h。将纤维膜洗涤后用ECL显示免疫反应条带，采用ImageJ软件进行图像分析处理。
1.7 统计学分析采用SPSS 11.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以x±s表示，偏态分布的计量资料采用中位数描述，计数资料采用率(%) 表示。组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 Src-TKI和EGF对肺腺癌细胞浸润的影响比较在不同组别下肺癌细胞的浸润情况。在不加入EGF的情况下，Src-TKI可以有效的抑制PC-9和A549细胞的浸润。1 μmol/L Src-TKI就能抑制超过90%的PC-9细胞浸润和超过40%的A549细胞浸润(P < 0.01)，同时结果显示Src-TKI具有浓度依赖性抑制作用，浓度升高，抑制率增加。单独加入EGF时，2种细胞的浸润率明显升高。Src-TKI可以明显抑制由EGF诱导的肺癌细胞浸润，在PC-9细胞中浸润率从667%降至30%，A549细胞浸润率从334%降至43% (P < 0.05)。提示EGF可以刺激PC-9和A549细胞的浸润，而Src-TKI可抑制这种浸润。台盼蓝染色实验证实，Src-TKI对细胞活力几乎无影响，见表 1、2。
| Group | Invasion rate | Activity rate |
| A1 | 100.00±16.12 | 100.00±14.52 |
| B1 | 36.95±5.951) | 92.25±10.54 |
| C1 | 8.69±4.861) | 69.88±8.51 |
| D1 | 667.39±65.931) | 91.52±15.66 |
| E1 | 652.17±86.961) | 87.20±8.49 |
| F1 | 30.43±11.901) | 80.04±8.70 |
| 1) P < 0.05 compared with activity rate in the same group. | ||
| Group | Invasion inhibit rate | Activity inhibit rate |
| A2 | 100.00±16.42 | 100.00±22.56 |
| B2 | 59.09±22.341) | 90.65±26.56 |
| C2 | 21.21±6.331) | 86.84±14.76 |
| D2 | 354.54±50.651) | 117.73±22.94 |
| E2 | 242.42±47.001) | 100.09±32.49 |
| F2 | 43.93±11.231) | 112.20±32.30 |
| 1) P < 0.05 compared with activity inhibit rate in the same group. | ||
2.2 Src-TKI和EGF对肺癌细胞增殖的影响
根据加入EGF和Src-TKI浓度进行分组，结果表明Src-TKI在3 μmol/L可明显抑制PC-9和A549细胞增殖(P < 0.05)。同时结果显示EGF可以明显的刺激细胞增殖。当EGF和Src-TKI同时加入时，A549和PC-9细胞增殖也受到抑制，随着Src-TKI浓度增加，细胞增殖率下降。提示Src-TKI可抑制肺癌细胞增殖，且呈浓度依赖性抑制作用(P < 0.05)。见表 3。
| Group | Proliferation rate | |
| A549 | PC-9 | |
| EGF 0 ng/mL | ||
| Src-TKI 0 μmol/L | 100.00±5.33 | 99.99±8.32 |
| Src-TKI 0.1 μmol/L | 81.60±9.06 | 56.24±6.62 |
| Src-TKI 0.3 μmol/L | 78.03±4.67 | 48.81±4.85 |
| Src-TKI 1.0 μmol/L | 63.09±6.89 | 41.38±2.34 |
| Src-TKI 3.0 μmol/L | 59.52±3.27 | 32.93±3.88 |
| EGF 10 ng/mL | ||
| Src-TKI 0 μmol/L | 110.47±10.04 | 116.72±14.38 |
| Src-TKI 0.1 μmol/L | 112.50±8.38 | 96.62±11.00 |
| Src-TKI 0.3 μmol/L | 96.78±10.36 | 77.02±9.20 |
| Src-TKI 1.0 μmol/L | 80.53±5.65 | 74.49±4.52 |
| Src-TKI 3.0 μmol/L | 52.55±2.44 | 55.06±16.48 |
2.3 Src-TKI和EGF对酪氨酸激酶磷酸化的影响
采用Western blotting分析酪氨酸激酶磷酸化情况，得到不同分子量的酪氨酸激酶蛋白梯带(图 1)。当EGF加入时，酪氨酸激酶磷酸化增强，当Src-TKI加入时，酪氨酸激酶磷酸化被抑制，当同时加入EGF和Src-TKI时，磷酸化程度弱于单独加入EGF时磷酸化程度。
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| 图 1 Src-TKI和EGF对酪氨酸激酶磷酸化影响 Fig.1 Effects of Src-TKI and EGF on tyrosine kinase phosphorylation |
2.4 Src-TKI和EGF对Src及其下游蛋白磷酸化的影响
Src-TKI对Src蛋白的表达没有影响，EGF可增强Src、MAPK、Akt和EGFR磷酸化，Src-TKI可明显抑制其磷酸化。同时，随着Src-TKI浓度升高，抑制程度增加。见图 2。
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| A，PC-9；B，A549. 图 2 Src-TKI和/或EGF对EGFR、MAPK、Akt和Src磷酸化的影响 Fig.2 Effects of SrC-TKI and/or EGF on the phosphorylation of EGFR, MAPK, Akt, and Src |
3 讨论
Src是非受体酪氨酸激酶，参与包括EGFR在内的许多信号通路[9-10]。Src参与EGF诱导的细胞增殖，可以活化Grb2/Sos/Ras/Raf/MEK/MAPK和PI3K/Akt瀑布反应。Src可以与活化的受体酪氨酸激酶相互作用[11]，作为一个上层激活剂，可以正向调节EGFR信号通路，增强EGFR及其下游信号通路磷酸化[12]。活化的Src酪氨酸激酶也可以通过参与PGE2/EP3/SRC信号通路反式激活EGFR，从而促进NSCLC增殖[13]。
EGFR是一个单通道跨膜酪氨酸激酶，由细胞外配体结合域、疏水跨膜区、细胞内受体酪氨酸激酶域和C端胞质尾组成，参与同源或异源二聚化和酶活化[14]。Src与EGFR为协同作用[15]，可以调节EGFR磷酸化，导致受体过度活化，增强受体基质磷酸化程度。同时研究[15]证实Src激酶通过Y845位点磷酸化EGFR。EGF是生长因子，可以刺激表皮细胞生长，联合至少7种其他生长因子和它们的跨膜受体激酶参与细胞生长增殖。当持续接触EGF时，EGFR被激活且可以促进细胞生长和恶性化。本研究结果显示，EGF可以促进细胞增殖浸润，激活EGFR及其下游信号，EGFR、Src、MAPK和Akt磷酸化程度增强[16]。
此外，本研究发现Src-TKI可以有效抑制肺腺癌细胞增殖浸润。Src-TKI可以抑制Src活化，而不影响Src蛋白表达，同时抑制EGFR、Akt和MAPK磷酸化。Src-ras-MAPKK-MAPK是EGFR的一条信号通路，细胞外受体与配体结合，EGFR和Src磷酸化，Ras被激活。活化的Ras将激活Raf、MEK和MAPK。磷酸化的MAPK介入细胞循环，促进细胞增殖。当Src-TKI抑制Src磷酸化时，MAPK也被抑制。
Src通过位点Y845诱导EGFR磷酸化。然而，Src-TKI不仅仅是通过Y845位点抑制EGFR磷酸化。本研究结果显示，当EGF和Src-TKI同时加入PC-9和A549细胞时，MAPK、EGFR、Akt磷酸化同样受到抑制。推测是Src-TKI通过抑制EGFR的Y845、Y1086和(或)Y1173位点，抑制EGFR的磷酸化。因此，Src-TKI可以有效抑制MAPK和Akt磷酸化，抑制EGFR下游信号如Akt (Y1086下游信号)，从而诱导细胞凋亡。
综上所述，Src-TKI可以通过抑制Src、EGFR、Akt和MAPK磷酸化抑制肺腺癌PC-9和A549细胞增殖和浸润。本研究为抑制肺癌进展和转移，延长肺癌患者生存时间提供了新的可能。
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