结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率全球排名第三，死亡率全球排名第二^[1]。大约25%的结直肠癌患者在最初诊断时伴有远处转移^[2]，如果不治疗，晚期结直肠癌转移患者的中位生存时间仅为5~6个月^[3]。研究^[4-5]表明，结直肠癌的转移部位受原发肿瘤位置的影响。虽然原发肿瘤来源相同，但不同转移部位的结直肠癌预后有显著差异。尽管一些分子标志物如KRAS/RAS、错配修复与结直肠癌的转移部位有关^[6-7]，但是不同转移部位的结直肠癌基因变化尚不明确。本研究通过加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA），鉴定可能对转移性结直肠癌至关重要的基因模块和核心基因，并分析与其相关的核心基因的预后价值，为寻找结直肠癌的诊断生物标志物提供理论基础。

1 材料与方法 1.1 数据集和数据处理

从高通量基因表达数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）下载基因表达数据集GSE41568^[8]。该数据集由39例原发性结直肠癌样本和94例转移性结直肠癌样本组成。根据不同的通路激活模式，将该数据集样本分为6个结直肠癌分子亚组。

1.2 差异表达基因的筛选

对原始微阵列数据进行RMA算法背景校正和对数转换，然后使用R语言（版本3.3.2）和Bioconductor软件包将数据进行归一化处理，应用Limma包筛选结直肠癌样本间的差异表达基因。将P < 0.05和|log₂FC| > 0.5作为筛选标准。

1.3 共表达网络的构建和核心基因的检测

使用R语言中的WGCNA软件包构建差异表达基因的加权基因共表达网络。此外，分别使用拓扑重叠矩阵和动态树切割算法进行分层聚类和模块筛选^[9]。最后筛选出与转移性结直肠癌相关的核心基因^[10]。

1.4 核心基因的功能注释和蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction network，PPI）网络的建立

通过STRING^[11]找到基因之间的相互作用，选择综合得分 > 0.4的相互作用，利用Cytoscape软件构建并可视化这些基因的PPI网络。通过注释、可视化和集成发现数据库对筛选的差异表达基因进行基因本体（gene ontology，GO）以及京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。将假发现率（false discovery rate，FDR） < 0.05作为显著性的分界点。

1.5 核心基因的生存分析

应用PROGgenesV2预测数据集研究核心基因表达水平与结直肠癌患者总生存期的相关性。根据载脂蛋白H（apolipoprotein H，APOH）、纤维蛋白原γ链（fibrinogen gamma chain，FGG）、激肽原1（kininogen 1，KNG1）的表达水平对队列进行划分。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.6 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

根据3个核心基因的中位表达值，将样本分为核心基因低表达组和核心基因高表达组，然后使用Broad Institute平台^[12]执行GSEA。

2 结果 2.1 差异表达基因的识别

转移性结直肠癌和原发性结直肠癌之间共鉴定出1 159个差异表达基因，包含703个上调基因和456个下调基因（图 1）。

2.2 共表达网络的构建以及核心模块和基因筛选

根据加权基因共表达网络（图 2A），将基于相似表达模式的差异表达基因分为不同的模块。如图 2B~2E所示，软阈值β = 14，选择最低的无标度拓扑拟合指数0.9用于后续的邻接计算。通过差异表达基因的共表达模块（图 2F），发现了与转移部位最相关的绿色模块（r = 0.51，P = 5e-10；图 2G），将其命名为转移模块，并进行后续分析。利用绿色模块中的基因绘制模块成员（module membership，MM）与基因显著性的散点图，这表明MM值与基因显著性具有高度相关性，表明绿色模块适合研究与结直肠癌转移状态相关的核心基因（图 2H）。然后，根据高MM值和加权q < 0.001的基因，选择绿色模块中前50个核心基因。

GO注释和KEGG通路富集分析结果发现，转移模块中基因的生物学过程在“创伤反应”“急性炎症反应”“蛋白质-脂质复合物组装”“血浆脂蛋白颗粒组装”和“炎症反应”中富集。对于细胞成分，核心基因在“细胞外区域”“细胞外空间”“细胞外区域部分”“G蛋白脂质复合物”和“血浆脂蛋白颗粒”中显著富集。分子功能分析显示，前50个核心基因主要富集于“酶抑制剂活性”“内肽酶抑制剂活性”“肽酶抑制剂活性”“丝氨酸型内肽酶抑制剂活性”和“细胞表面结合”。见表 1。此外，KEGG通路富集分析表明，前50个核心基因主要富集在“补体和凝血级联”中。

2.3 转移模块中核心基因PPI网络的构建

通过Cytoscape软件，选择置信度 > 0.4构建PPI网络（图 3）。在PPI网络中，选择连通度 > 10的基因作为“真实”核心基因。

2.4 核心基因的生存分析

APOH、FGG和KNG1低表达与结直肠癌患者的总生存期延长显著相关（图 4）。

2.5 核心基因的GSEA与结直肠癌患者的总生存期显著相关

核心基因高表达组的结直肠癌样本在“细胞外刺激反应”基因集中持续富集，见图 5。

3 讨论

本研究应用WGCNA鉴定与结直肠癌不同转移部位相关的基因共表达模块和基因。在一个重要的绿色模块中筛选了前50个核心基因，随后将共表达网络和PPI网络中的共同核心基因视为“真实”核心基因，进行进一步分析。其中，APOH、FGG和KNG1与结直肠癌转移患者的预后密切相关，本研究对这3个基因的重要生物学过程进行了分析。

与转移性结直肠癌相关的绿色模块中，核心基因在炎症反应中富集，这与已发表的研究结果一致。研究^[13]报道，全身炎症反应对晚期结直肠癌患者尤其是结直肠癌肝转移患者具有预后价值。此外，炎症细胞的募集是“创伤反应”的一个特征，表皮生长因子将这些细胞聚集并参与癌症转移^[14]。因此，炎症和创伤反应在结直肠癌转移过程中的具体作用值得进一步研究。

APOH也被称为β2糖蛋白Ⅰ，主要参与脂质代谢和胆固醇转运。本研究中，与原发性大肠癌相比，转移性大肠癌中APOH的表达上调，并且与大肠癌患者的预后呈负相关，这表明APOH可能在转移性结直肠癌中发挥致癌作用。

KNG1在许多病理生理过程中发挥重要作用，包括纤维蛋白溶解和血栓形成，并在肿瘤发生中发挥作用^[15]。研究^[16]表明，KNG1的细胞质积累与结直肠癌的分期和淋巴结转移状态显著相关。以上证据提示，KNG1可能影响结直肠癌的转移。

FGG是纤维蛋白原的组成部分，在血液凝固、纤维蛋白溶解以及细胞和基质相互作用过程中发挥重要作用^[17]。最近，ZHANG等^[18]发现上调的FGG通过调节Slug和ZEB1的表达，激活上皮-间质转化途径，促进肝癌细胞的迁移和侵袭；此外，肝细胞癌组织中FGG的表达水平也被证明是手术切除后无病生存期的独立危险因素。尽管FGG在大肠癌转移中的作用尚未被研究，但上述证据表明FGG可能是大肠癌转移过程中潜在的关键因素。

此外，本研究结果表明，核心基因高表达组在“细胞外刺激反应”基因集中富集。这些证据表明，APOH、FGG、KNG1可能通过影响细胞间或细胞基质黏附而促进结直肠癌转移。本研究筛选的这些基因为结直肠癌转移提供了更详细的分子机制，可作为潜在的生物标志物和治疗靶点。