2023, Vol. 52文章信息
- 孙炜, 吴春明, 刘张, 难波宏树
- SUN Wei, WU Chunming, LIU Zhang, NAMBA Hiroki
- 6-羟基多巴胺损毁单侧内侧前脑束和单侧纹状体的帕金森病大鼠模型早期和晚期行为学
- Behavior at early and later stages after unilateral medial forebrain bundle and striatal lesions induced by 6-hydroxydopamine in a rat model of Parkinson disease
- 中国医科大学学报, 2023, 52(2): 120-125
- Journal of China Medical University, 2023, 52(2): 120-125
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文章历史
- 收稿日期：2022-10-10
- 网络出版时间：2023-01-31 14:33:33
引用本文 |
2. 大连医科大学附属第一医院儿科, 辽宁 大连 116011;
3. 日本滨松医科大学附属医院神经外科, 静冈 滨松 431-3192
2. Department of Pediatrics, The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, China;
3. Department of Neurosurgery, Hamamatsu University School of Medicine, Hamamatsu 431-3192, Japan
目前，应用较多的帕金森病（Parkinson disease，PD）大鼠模型行为学测试方法有2种：一种是甲基苯丙胺或阿扑吗啡诱导的旋转运动，产生这种旋转运动主要是由单侧PD大鼠模型大脑两侧多巴胺（dopamine，DA）受体分布不平衡导致[1]；另一种是对模型运动迟缓或僵硬症状进行评估，如步行实验或旋转棒实验[2-6]。在既往关于纹状体损毁PD大鼠模型的研究[2-3]中，尽管不同模型DA神经元脱失存在差异，但纹状体损伤程度不同的大鼠模型的旋转行为和步行实验结果相近。这一行为学结果与传统观点矛盾，即运动障碍程度总是与PD中DA神经元脱失呈正相关[7]。而上述行为学结果均是在损伤后早期发现，即在注射6-羟基多巴胺（6-OHDA）3~4周后。因此，本研究采用甲基苯丙胺诱导的旋转实验、溴隐亭诱导的旋转实验和步行实验，检测大鼠内侧前脑束（medial forebrain bundle，MFB）损毁模型和纹状体损毁模型在注射6-OHDA后早期（成模后4周）和晚期（成模后6个月）的行为学变化，以进一步探讨不同PD大鼠模型在不同时期的行为学表现，从而为模型选择提供参考。
1 材料与方法 1.1 动物模型和分组选择62只成年雄性Sprague-Dawley大鼠（滨松医科大学动物实验中心提供），体质量270~290 g。根据随机数字表，随机分为4组：1位点纹状体损毁模型组（n = 18）、4位点纹状体损毁模型组（n = 18）、MFB损毁模型组（n = 18）和假手术组（n = 8）。检测所有大鼠在模型制备成功后早期和晚期的行为学变化。
1.2 建模方法大鼠腹腔内注射Equithesin（3 mL/kg，日本共立制药株式会社）充分麻醉后，接受单侧脑内立体定向手术。根据分组，将6-OHDA（美国Sigma-Aldrich公司）按不同三维坐标位置注射到纹状体（1个位点、4个位点）或MFB中。将6-OHDA（7 mg）溶解在0.9%盐水（7 mL）中，形成1 µg/µL浓度的溶液。使用微量注射器以1 µL/min的速度注射6-OHDA（7 µg）。假手术组按照4位点纹状体损毁模型的三维坐标位置单侧脑内注射无菌生理盐水，以排除手术因素对实验结果的影响。
1位点纹状体损毁模型6-OHDA注射的三维坐标：前囟前向（AP）=1.0 mm，中线右侧（L）=3.0 mm，腹侧距硬脑膜表面深度（V）=5.0 mm，齿杆（TB）=0 mm（水平）。4位点纹状体损毁模型6-OHDA注射的三维坐标：（1）AP = 1.3 mm，L=2.6 mm，V=5.0 mm，TB=0 mm；（2）AP = 0.4 mm，L=3.0 mm，V=5.0 mm，TB=0 mm；（3）AP = -0.4 mm，L=4.2 mm，V=5.0 mm，TB=0 mm；（4）AP = -1.3 mm，L=4.5 mm，V=5.0 mm，TB=0 mm。MFB损毁模型6-OHDA注射的三维坐标：（1）AP = -4.4 mm，L=1.2 mm，V=7.8 mm，TB=2.4 mm（高于地平线）；（2）AP = -4.0 mm，L=0.8 mm，V=8.0 mm，TB=-3.4 mm（低于地平线）。
1.3 旋转实验和步行实验在成模早期和晚期，参照本课题组已发表文献[2-3]，依次进行甲基苯丙胺诱导的旋转实验、溴隐亭诱导的旋转实验和步行实验。在腹膜内注射甲基苯丙胺（3 mg/kg）后，监测大鼠的旋转运动至少1 h。在腹腔内注射溴隐亭（5 mg/kg）后，监测大鼠的旋转运动至少2 h。统计净旋转数。
1.4 免疫组织化学使用免疫组织化学结合无偏体视学方法，统计大鼠脑黑质中DA能细胞的数量。所有大鼠均腹腔注射水合氯醛（30 mg/100 g，美国迈兰制药公司）深度麻醉，取出大脑组织，切片后进行酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）免疫组织化学染色，计数各组大鼠模型病灶侧黑质致密部TH阳性DA神经元数量，通过与假手术组病灶侧的TH阳性DA神经元总数对比，计算病灶侧TH阳性DA神经元脱失率。
1.5 结合分析实验示踪剂由日本滨松光子学公司回旋加速器实验室合成，用于配体-受体结合分析实验。本研究应用2种示踪剂：DAT配体11C-CFT和D2受体配体11C-raclopride。在成模早期和晚期，进行结合分析实验。各组大鼠尾静脉注射11C-CFT和11C-raclopride后，分别测定大鼠脑内不同区域的放射活度。4位点纹状体损毁模型组7只大鼠、MFB损毁模型组7只大鼠和假手术组3只大鼠注射11C-CFT，放射活度为（11.1±0.5）MBq；4位点纹状体损毁模型组7只大鼠、MFB损毁模型组7只大鼠和假手术组3只大鼠注射11C-raclopride，放射活度为（10.9±0.4）MBq。大鼠在麻醉状态下尾静脉注射示踪剂30 min后，取出脑组织，迅速在低温操作台上分离出双侧纹状体和小脑并称质量。应用自动伽马闪烁计量仪（美国Perkin Elmer公司）测定脑组织的放射活度。计算病灶侧DA转运蛋白和D2受体结合率，结合率（%）=（病灶侧相对放射活度-对侧相对放射活度）/对侧相对放射活度×100。如果损毁病灶侧相对放射活度大于对侧相对放射活度，结果为正值，代表病灶侧结合率增高；如果结果为负值，代表病灶侧结合率降低；如果为零，代表病灶侧与对侧结合率无差别。
1.6 统计学分析应用SPSS 20.0软件进行数据分析。行为学实验数据均以x±s表示。2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 免疫组织化学染色和结合分析实验结果免疫组织化学染色结果显示，成模早期和晚期，1位点纹状体损毁模型组黑质中TH阳性DA神经元脱失率约为20%，4位点纹状体损毁模型组约为85%，MFB损毁模型组超过95%。成模早期和晚期不同模型组间比较，1位点纹状体损毁模型组DA神经元脱失率明显低于4位点纹状体损毁模型组和MFB损毁模型组（均P < 0.01），4位点纹状体损毁模型组明显低于MFB损毁模型组（P < 0.05）。同一模型组中成模早期和晚期比较，DA神经元脱失率的差异无统计学意义（P > 0.05）。见图 1、表 1。
|
| The solid line arrow shows TH-positive dopamine neurons, and the dotted line arrow shows the loss of dopamine neurons after lesion. 图 1 PD大鼠模型脑组织切片TH免疫组织化学染色 Fig.1 TH immunohistochemical staining results of brain tissue sections of rat PD model |
| Time point | 1-lesion striatal model group（n = 18） | 4-lesion striatal model group（n = 18） | MFB model group（n = 18） |
| Early stage | 20.1±6.8 | 85.3±5.11） | 96.4±0.51），2） |
| Later stage | 21.9±2.7 | 85.4±4.11） | 95.3±1.71），2） |
| 1）P < 0.01 vs 1-lesion striatal model at the same time point；2）P < 0.05 vs 4-lesion striatal model at the same time point. | |||
结合分析实验结果显示，成模早期和晚期，4位点纹状体损毁模型组、MFB损毁模型组与假手术组比较，MFB损毁模型组与4位点纹状体损毁模型组比较，病灶侧DA转运蛋白结合率均显著下降（均P < 0.05）；4位点纹状体损毁模型组和MFB损毁模型组中，成模早期与晚期比较，病灶侧DA转运蛋白结合率的差异均无统计学意义（均P > 0.05）。成模早期和晚期，4位点纹状体损毁模型组与假手术组比较，病灶侧D2受体结合率均显著下降（均P < 0.05）；4位点纹状体损毁模型组中，成模早期与晚期比较，病灶侧D2受体结合率的差异无统计学意义（P > 0.05）。成模早期和晚期，MFB损毁模型组与假手术组比较，病灶侧D2受体结合率均显著升高（P < 0.05）；MFB损毁模型组中，成模晚期与早期比较，病灶侧D2受体结合率明显降低（P < 0.05）。且成模早期和晚期，MFB损毁模型组病灶侧D2受体结合率均显著高于4位点纹状体损毁模型组（均P < 0.05）。见表 2。
| Group | n | Binding rate of dopamine transporters | Binding rate of D2 receptors |
| 4-lesion striatal model | 18 | ||
| Early stage | -23.7±5.01） | -18.0±5.01） | |
| Later stage | -26.5±2.81） | -20.6±2.71） | |
| MFB model | 18 | ||
| Early stage | -62.9±7.01），2） | 35.0±6.01），2） | |
| Later stage | -64.6±1.41），2） | 8.6±2.71），2），3） | |
| Sham operated | 8 | ||
| Early stage | 0.0±0.0 | 0.0±0.0 | |
| Later stage | 0.0±0.0 | 0.0±0.0 | |
| 1）P < 0.05 vs sham operated group at the same time point；2）P < 0.05 vs 4-lesion striatal model at the same time point；3）P < 0.05 vs early stage within group. | |||
2.2 旋转实验结果
腹腔注射3 mg/kg甲基苯丙胺后，1位点纹状体损毁模型组、4位点纹状体损毁模型组和MFB损毁模型组大鼠均诱发产生朝向病灶同侧的旋转，成模早期和晚期不同模型组间比较以及同一模型组中成模早期与晚期比较，每分钟大鼠模型的净旋转圈数均无统计学差异（P > 0.05）。见表 3。
| Time point | 1-lesion striatal model group（n = 18） | 4-lesion striatal model group（n = 18） | MFB model group（n = 18） |
| Early stage | 6.83±0.75 | 6.63±0.76 | 6.99±0.73 |
| Later stage | 6.78±0.73 | 6.81±0.69 | 6.89±0.77 |
腹腔注射5 mg/kg溴隐亭后，1位点纹状体损毁模型组和4位点纹状体损毁模型组均产生朝向病灶同侧的旋转，但成模早期或晚期2组间比较以及同一模型组成模早期与晚期比较，旋转圈数均无统计学差异（均P > 0.05）；MFB损毁模型组在成模早期和晚期均产生朝向病灶对侧的旋转，但成模早期和晚期比较，旋转圈数无统计学差异（P > 0.05）。见表 4。
| Time point | 1-lesion striatal model group（n = 18） | 4-lesion striatal model group（n = 18） | MFB model group（n = 18） |
| Early stage | 22.01±2.23 | 21.92±2.19 | -27.17±3.65 |
| Later stage | 23.38±2.53 | 21.86±3.01 | -26.77±2.93 |
2.3 步行实验结果
步行实验结果显示，同一模型组中，成模早期和晚期病侧肢体运动启动时间明显长于健侧肢体（P < 0.001），病侧肢体步长长度明显短于健侧肢体（P < 0.001），病侧肢体前后步伐调整数明显少于健侧肢体（P < 0.001）；同一模型组中，病侧肢体成模早期与晚期、健侧肢体成模早期与晚期比较，上述结果均无统计学差异（P > 0.05）；成模早期和晚期，3个模型组中病侧肢体间比较、健侧肢体间比较，上述结果也均无统计学差异（P > 0.05）。见表 5。
| Item | 1-lesion striatal model group（n = 18） | 4-lesion striatal model group（n = 18） | MFB model group（n = 18） | |||||
| Lesion side | Normal side | Lesion side | Normal side | Lesion side | Normal side | |||
| Initiation time of stepping（s） | ||||||||
| Early stage | 19.79±2.741） | 5.56±0.63 | 20.91±2.971） | 5.33±0.65 | 20.22±2.761） | 5.53±0.70 | ||
| Later stage | 19.82±2.811） | 5.49±0.68 | 20.17±2.891） | 5.68±0.71 | 19.97±2.861） | 5.42±0.61 | ||
| Stepping length（cm） | ||||||||
| Early stage | 10.22±0.461） | 14.12±0.24 | 10.31±0.561） | 14.25±0.25 | 10.07±0.601） | 14.19±0.32 | ||
| Later stage | 10.38±0.391） | 14.49±0.27 | 10.29±0.591） | 14.37±0.29 | 10.16±0.611） | 14.22±0.33 | ||
| Adjusting steps of stepping | ||||||||
| Early stage | ||||||||
| Forward | 2.29±0.301） | 6.04±0.55 | 2.46±0.331） | 6.44±0.51 | 2.33±0.371） | 6.58±0.54 | ||
| Backward | 4.75±0.661） | 11.94±0.45 | 4.79±0.721） | 11.83±0.46 | 4.71±0.741） | 11.88±0.41 | ||
| Later stage | ||||||||
| Forward | 2.27±0.311） | 6.34±0.53 | 2.49±0.381） | 6.47±0.56 | 2.39±0.321） | 6.56±0.51 | ||
| Backward | 4.72±0.691） | 11.89±0.41 | 4.73±0.711） | 11.85±0.42 | 4.77±0.721） | 11.82±0.47 | ||
| 1）P < 0.001 vs normal side at the same time point. | ||||||||
3 讨论
本研究对纹状体损毁模型和MFB损毁模型成模早期和晚期进行比较，发现病灶侧黑质中DA神经元脱失率以及纹状体DA转运蛋白结合率存在统计学差异，而甲基苯丙胺诱导的旋转实验和步行实验结果却无统计学差异，甚至步行实验中最敏感的指标——肢体运动启动时间也无统计学差异；另一方面，4位点纹状体损毁模型和MFB损毁模型中D2受体结合率呈完全相反的动态变化趋势，而溴隐亭诱导的旋转实验却可以比较敏感地反映与2种模型D2受体结合率动态变化趋势相对应的行为学差异。但在评价MFB损毁模型成模早期和晚期D2受体结合率差异方面，溴隐亭诱导的旋转实验不够敏感，结果无统计学差异。以往有研究[8-9]提示，PD大鼠模型行为学障碍的严重程度与DA神经元损伤程度密切相关，本研究结果与这些研究结果存在差异。
在临床中，通常认为PD患者运动障碍程度与黑质中DA神经元脱失以及纹状体DA水平降低程度呈正相关。而在动物实验中，PD大鼠模型只有在纹状体DA总水平降低40%~50%以及黑质中TH阳性神经元脱失30%~50%时才能产生甲基苯丙胺诱导的旋转现象[10-12]。此外，只有在纹状体DA水平降低80%~90%以及黑质中TH阳性神经元脱失60%~80%的情况下，才能在步行实验中观察到大鼠运动障碍[13]。相关研究[4, 7, 14]结果也提示，随着PD动物模型纹状体损伤程度的增加，运动障碍程度变得更加严重。而本研究结果显示，1、4位点纹状体损毁模型和MFB损毁模型黑质-纹状体系统中DA神经元脱失率有显著差异，按照上述以往的基础研究结果以及临床经验推测，这3种模型的反映运动障碍程度的行为学实验结果同样应该出现显著差异，但预期结果与实际结果并不一致。考虑到研究对象和研究方法的差异，很难将本课题组的研究结果与以往研究直接类比，但这些结果提示：甲基苯丙胺诱导的旋转实验和步行实验在评估PD模型DA神经元损伤状态方面不够敏感。产生这一结果可能的原因如下：大鼠模型肢体运动产生的行为学表现可能受到DA能系统中多个因素的复杂、综合性影响，这些因素可能包括DA递质水平、乙酰胆碱递质水平以及DA转运蛋白和DA受体的数量。DA能系统中不同递质间的复杂相互作用（激活、抑制和代偿等）最终决定了行为学表现。因此，尽管DA神经元功能丧失是导致PD行为学异常最主要的因素，但将行为学表现仅与DA神经元脱失水平联系起来并不合理。由于DA能系统在维持动物的生存方面起非常重要的作用，因此在DA能神经元受损的情况下，可能发生一系列未知的代偿性病理生理过程，以减轻运动障碍的严重程度。这一推测需要未来进行更多的研究予以证实。
本研究选择了几种不同类型的行为学实验评估模型的运动障碍程度，这些行为学产生的内在机制不尽相同。本课题组既往进行的PD大鼠模型研究中，选择过用于评价DA受体分布不平衡程度的旋转运动、评价运动迟缓症状的步行实验以及评价肌强直症状的大鼠转棒实验。目前，在啮齿类动物PD模型中尚无成熟的实验用以评估静止性震颤。通过不同机制的行为学实验来评估不同类型的运动障碍症状，可以减少评估模型的观察偏倚。
本研究发现，MFB损毁模型D2受体结合率发生显著动态变化，成模早期急剧上升，成模晚期这种上升态势开始显著回落；而4位点纹状体损毁模型D2受体结合率无论在成模早期还是晚期都呈下降态势，而且早晚期比较无统计学差异。成模早期和晚期D2受体结合率在2种模型中相反的变化情况在溴隐亭诱导的旋转实验中也产生了相应的结果，注射溴隐亭后，4位点纹状体损毁模型产生了朝向病灶同侧的旋转，而MFB损毁模型则产生朝向病灶对侧的旋转，考虑到溴隐亭作为DA受体激动剂的功效，这一旋转结果敏感地反映出2种模型D2受体在病灶侧和健康侧的不平衡分布情况。然而，当MFB损毁模型D2受体结合率在成模早期和晚期出现动态变化时，溴隐亭诱导的旋转实验却无法敏感地反映出这种差别，成模早期和晚期实验结果并无统计学差异。这些结果进一步说明，应用某一单项行为学数据无法全面阐明DA能系统内多因素相互作用的机制。
下一步本课题组将应用小动物正电子发射断层扫描对不同大鼠PD模型D2受体结合率进行多时间点连续动态在体检测，进一步明确D2受体结合率升高的峰值是在损毁后4周出现还是更晚的时间出现、D2受体结合率是否在损毁6个月后继续下降等问题。同时探寻新的能够反映与大鼠模型行为学异常表现相关的示踪剂以及开发新的行为学实验方法，用于研究早、中、晚期不同病程阶段大鼠模型运动障碍情况与DA能系统中多种递质动态变化之间的关系，从而在分子水平为进一步阐明PD运动障碍症状与DA能系统功能之间的关系提供新的参考指标。
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