2023, Vol. 52文章信息
- 陈阳, 高文婷, 李肖, 姬晓彤, 白剑英
- CHEN Yang, GAO Wenting, LI Xiao, JI Xiaotong, BAI Jianying
- 双酚A及其3种替代物对肝细胞甘油三酯合成的影响
- Effects of bisphenol A and its three analogs on triglyceride synthesis in hepatocytes
- 中国医科大学学报, 2023, 52(12): 1068-1073
- Journal of China Medical University, 2023, 52(12): 1068-1073
-
文章历史
- 收稿日期：2023-04-21
- 网络出版时间：2023-12-07 11:13:31
引用本文 |
2. 煤炭环境致病与防治教育部重点实验室，太原 030001
2. Key Laboratory of Coal Environmental Pathogenicity and Prevention, Ministry of Education, Taiyuan 030001, China
双酚A [2，2-bis (4-hydroxyphenyl) propane，BPA]是一种典型的环境内分泌干扰物，广泛用于生产聚碳酸酯和环氧树脂等[1-2]。研究[3-7]表明，BPA可增加女性不孕和复发流产率，与肥胖、2型糖尿病、肝功能异常的发生有关，还可增加患癌症的风险。BPA可通过调节脂肪酸从头合成相关基因的表达，影响脂质合成[8]，此外，成年小鼠长期接触BPA会增加其肝脏的脂质含量[9]。越来越多的研究[10-11]表明BPA具有毒性作用，因此，BPA的使用已受到限制。近年来，某些结构上类似于BPA的新型化学物，如双酚AF [4，4’-(hexafluoroisopropylidene) diphenol，BPAF]、双酚B [2-bis (4-hydroxyphenyl) butane，BPB]、双酚S (4-hydroxyphenyl sulfone，BPS) 和双酚F (4，4’-methylenediphenol，BPF) 作为BPA的替代品被广泛使用。研究[12-14]显示，在水、沉积物等环境介质中均检测到BPA及类似物。在中国南京高淳区学龄前儿童尿样中，典型双酚类似物BPA、BPAF、BPF和BPS的总质量浓度为2~3 113 ng·L-1，与我国深圳和广州3~11岁儿童的检测结果一致[15]。
由于BPA及其类似物存在化学结构的相似性，BPA类似物是否安全也受到了广泛关注。我国的一项流行病学研究[16]发现，暴露于BPS可增加非酒精性脂肪肝(non-alcohol fatty liver disease，NAFLD) 的发病率。LIU等[17]研究发现，部分BPA类似物可导致细胞内甘油三酯(triglyceride，TG) 合成增多。因此，BPA类似物对肝细胞脂代谢的作用值得深入研究。本研究拟观察BPA、BPAF、BPB和BPS染毒HL-7702细胞后，细胞内脂质蓄积情况、TG含量及TG合成相关基因的mRNA表达水平，以探讨BPA、BPAF、BPB和BPS是否引起肝细胞脂质蓄积，为制定BPA及其类似物的环境卫生标准提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 细胞人正常肝细胞株HL-7702，由陕西中医药大学秦绪军教授惠赠。
1.1.2 主要仪器Galaxy 170S CO2培养箱(德国Eppendorf公司)，Model 680型酶标仪(美国Bio-rad公司)，UV-2450型紫外分光光度仪(上海纳诺仪器有限公司)，line gene 9600型荧光定量PCR仪(杭州BIOER科技有限公司)，HFsafe-1200型生物安全柜[力新仪器(上海) 有限公司]，高速低温离心机Neofuge 15R [力新仪器(上海) 有限公司]，倒置荧光显微镜BX51 (日本Olympus公司)。
1.1.3 主要试剂BPA、BPAF、BPB、BPS (上海梯希爱化成工业发展有限公司)，DMEM高糖培养基(上海金畔生物科技有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，二甲基亚砜、胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)，BCA试剂盒(武汉博士德生物有限公司)，油红O粉末(美国Sigma公司)，TG试剂盒(南京建成生物工程研究所)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，SYBR ®Premix Ex TaqTMⅡ (上海翌圣生物科技有限公司)，反转录试剂盒Primer Script RT MASTER Mix、RNA提取试剂RNAiso Plus (日本TaKaRa公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养将人正常肝细胞HL-7702接种于DMEM完全培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
1.2.2 实验分组及染毒选取对数生长期细胞，接种于细胞培养板并培养。待细胞密度约达80%时，将细胞随机分为6组，分别为空白对照组，溶剂对照(0.1% DMSO) 组，油酸(1 mmol/L OA)组，1、10、50 μmol/L BPA、BPAF、BPB和BPS组。于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h后进行后续相关实验。
1.2.3 油红O染色选取对数生长期细胞接种于6孔板中，按上述分组进行染毒，染毒时每组设置3个平行孔，染毒24 h后，用PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，加入60%异丙醇浸洗5 min，加入油红O工作液浸染20 min (常温避光)，加入苏木素复染核1 min，倒置显微镜下观察细胞内出现脂滴的情况，并采集图像。
1.2.4 GPO-PAP酶法测定细胞内TG含量细胞染毒24 h，用PBS漂洗2次，胰酶消化后，加入1 mL PBS缓冲液制成细胞悬液，其中250 μL于1 000 r/min离心10 min后弃上清，用BCA法测定蛋白浓度，其余750 μL用于测定TG含量。按照文献[18]的方法，用异丙醇、己烷、乙醚等有机溶剂抽提细胞内脂质。按试剂盒说明书操作步骤进行测定。
1.2.5 实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR) 测定肝细胞内TG合成相关基因mRNA的表达染毒结束后，用PBS清洗细胞2次，加入适量的RNAiso裂解细胞，提取RNA。用超微量紫外分光光度仪检测总RNA浓度和纯度，纯度范围为1.8~2.2。采用20 μL体系反转录，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，获得逆转录产物cDNA。以2 μL cDNA为模板，β-actin为内参，使用Line Gene 9600荧光定量PCR仪检测TG合成相关基因的mRNA表达水平。PCR引物序列见表 1。
| Primer | Primer sequence (5’-3’) | Product length (bp) |
| ACTIN-F | TGGCACCCAGCACAATGAA | 186 |
| ACTIN-R | CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA | 186 |
| LIPIN2-F | AATCAACGGCAGTGCAGTGGATC | 121 |
| LIPIN2-R | AATTGGTGAGGTGGCAAGGTAAGC | 121 |
| DGAT2-F | CCTGGCAAGAATGCAGTCAC | 186 |
| DGAT2-R | GGCCAAACCAATGTATTTCTGGA | 186 |
1.3 统计学分析
采用SPSS 26.0软件行统计学分析。计量资料用x±s表示。多组间比较先行方差齐性检验，再行单因素方差分析。组间两两比较时，方差齐时用LSD检验，方差不齐时用Games-Howell检验。检验水准为α=0.05。
2 结果 2.1 油红O染色结果如图 1所示，空白对照组与溶剂对照组细胞内未见红色脂滴，1 mmol/L OA组细胞内可见有大量红色脂滴，且红色脂滴围绕细胞膜内侧边缘呈环状分布，说明HL-7702脂肪变性模型建立成功，可作为阳性对照。与空白对照组和溶剂对照组相比，1、10、50 μmol/L BPA组、BPAF组、BPB组和BPS组细胞内均可观察到大小不等的红色脂滴。
|
| A, blank control group; B, solvent control group (0.1% DMSO); C, positive control group (oleic acid group); D, 50 μmol/L exposure group; E, 10 μmol/L exposure group; F, 1 μmol/L exposure group. The white arrows indicate red grease droplets. 图 1 BPA及其类似物染毒HL-7702细胞油红O染色结果×400 Fig.1 Oil red O staining results of HL-7702 cells exposed to BPA and its analogues ×400 |
2.2 细胞内TG含量
如图 2所示，处理HL-7702细胞24 h，与空白对照组和溶剂对照组相比，1 mmol/L OA组细胞内TG含量明显增加(P < 0.05)；1、50 μmol/L BPA组，10、50 μmol/L BPAF组，1、10、50 μmol/L BPB组和50 μmol/L BPS组细胞内TG含量明显增加(P < 0.05)。
|
| A, blank control group; B, solvent control group (0.1% DMSO); C, 1 μmol/L exposure group; D, 10 μmol/L exposure group; E, 50 μmol/L exposure group; F, oleic acid group. *P < 0.05 vs blank control group, #P < 0.05 vs solvent control group (0.1% DMSO). 图 2 BPA及其类似物染毒后肝细胞内TG含量(n = 3) Fig.2 Triglyceride content in liver cells after exposure to BPA and its analogues (n = 3) |
2.3 TG合成相关基因mRNA的表达
如图 3所示，处理HL-7702细胞24 h，与空白对照组和溶剂对照组相比，10 μmol/L BPAF组，1、10 μmol/L BPS组细胞LIPIN2 mRNA表达水平升高(P < 0.05)，与空白对照组相比，10 μmol/L BPB组细胞内LIPIN2 mRNA表达水平升高(P < 0.05)。与溶剂对照组相比，50 μmol/L BPAF组、50 μmol/L BPB组细胞内LIPIN2 mRNA表达水平升高(P < 0.05)。
|
| A, blank control group; B, solvent control group (0.1% DMSO); C, 1 μmol/L exposure group; D, 10 μmol/L exposure group; E, 50 μmol/L exposure group; F, oleic acid group. *P < 0.05 vs blank control group, #P < 0.05 vs solvent control group (0.1% DMSO). 图 3 BPA及其类似物染毒后肝细胞内LIPIN2 mRNA表达水平的变化(n = 3) Fig.3 Changes in LIPIN2 mRNA expression levels in liver cells after exposure to BPA and its analogues (n = 3) |
如图 4所示，处理HL-7702细胞24 h，与空白对照组和溶剂对照组相比，50 μmol/L BPA组、10 μmol/L BPAF组、50 μmol/L BPB组和1 μmol/L BPS组细胞内DGAT2 mRNA表达水平升高(P < 0.05)；与空白对照相比，1 mmol/L OA组细胞内DGAT2 mRNA表达水平升高(P < 0.05)，10 μmol/L BPB组细胞内DGAT2 mRNA表达水平升高(P < 0.05)；与溶剂对照组相比，10 μmol/L BPA组细胞内DGAT2 mRNA表达水平降低(P < 0.05)。
|
| A, blank control group; B, solvent control group (0.1% DMSO); C, 1 μmol/L exposure group; D, 10 μmol/L exposure group; E, 50 μmol/L exposure group; F, oleic acid group. *P < 0.05 vs blank control group, #P < 0.05 vs solvent control group (0.1% DMSO). 图 4 BPA及其类似物染毒后肝细胞内DGAT2 mRNA表达水平的变化(n = 3) Fig.4 Changes in the expression level of DGAT2 mRNA in liver cells after exposure to BPA and its analogues (n = 3) |
3 讨论
BPA及其类似物不仅对神经系统、生殖系统、内分泌系统及免疫系统具有毒性作用，而且对肝脏脂代谢也有一定的影响。但目前关于BPA及其类似物对肝脏脂代谢的研究还较少见。
本研究中，油红O染色结果发现，与空白对照组相比，1 mmol/L OA组细胞内有明显的脂肪蓄积，脂滴数量较多，且大小不等，围绕细胞膜内侧边缘呈环状分布，说明油酸用于建立HL-7702细胞脂肪变性模型成功。BPA、BPAF、BPB和BPS染毒不同剂量组细胞内均可观察到大小不等的红色脂滴，说明不仅是BPA，BPA类似物也可导致肝细胞内脂肪蓄积。TG含量测定发现，与空白和溶剂对照组相比，1、50 μmol/L BPA组，10、50 μmol/L BPAF组，1、10、50 μmol/L BPB组和50 μmol/L BPS组细胞内TG含量明显增加，其余各剂量组细胞内TG含量也有增加的趋势。因此，形态学观察和定量分析都表明BPA及其类似物BPAF、BPB和BPS均可导致肝细胞内脂肪蓄积，TG含量增加。
LIPIN家族蛋白具有磷脂酸磷酸酶活性，在脂质合成中起关键作用。细胞内脂肪酸水平升高时，存在于细胞质中的LIPIN蛋白转移至内质网(endoplasmic reticulum，ER)，与磷脂酸(phosphatidic acid，PA) 结合，并催化PA去磷酸化，促进甘油二酯(diacylglycerol，DAG) 合成[19]。卞京等[20]研究发现，宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation，IUGR) 大鼠肝脏中LIPIN2 mRNA及蛋白表达上调，可引起肝脏脂肪含量增加。孕期营养限制导致后代脂肪组织增多，脂肪细胞中LIPIN1和LIPIN2的过度表达导致TG积累增加[21]。贺真等[22]用MEHP处理人肝癌HepG2细胞，发现LIPIN2基因的高表达使细胞内TG含量明显增加，其高表达为细胞内TG合成的最后一步提供了更多的底物。二酰基甘油酰基转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT) 是催化TG合成最后一步反应的关键酶。DGAT2过表达使野生小鼠肝脏内TG含量增加[23]。ZHANG等[24]研究发现，DGAT2过表达可刺激牛骨骼肌卫星细胞中脂滴形成和TG积累。研究[20]发现，DGAT2 mRNA表达水平升高可促进HepG2细胞内TG合成增加。本研究中，BPA及其类似物染毒细胞24 h后，与空白对照组比较，10 μmol/L BPAF组，10 μmol/L BPB组，1、10 μmol/L BPS组细胞内LIPIN2 mRNA表达水平明显升高，50 μmol/L BPA组，10 μmol/L BPAF组，10、50 μmol/L BPB组和1 μmol/L BPS组细胞内DGAT2 mRNA表达水平均明显升高。BPAF、BPB和BPS均可通过上调LIPIN2和DGAT2 mRNA表达促进TG合成增加。BPA仅上调DGAT2 mRNA表达，说明BPA类似物影响肝细胞TG合成的途径可能更广泛，需要进一步研究。
综上所述，本研究发现BPA可能通过上调DGAT2 mRNA的表达促进TG合成的增加，导致人正常肝细胞内脂肪蓄积。不仅如此，BPAF、BPB及BPS还可能通过上调LIPIN2 mRNA的表达提供更多的DAG，进一步导致TG合成的增加，因此，BPA替代物的安全性值得进一步探讨。
| [1] |
PARK S, PARK S, JEONG M, et al. Fast and simple determination and exposure assessment of bisphenol A, phenol, p-tert-butylphenol, and diphenylcarbonate transferred from polycarbonate food-contact materials to food simulants[J]. Chemosphere, 2018, 203: 300-306. DOI:10.1016/j.chemosphere.2018.03.185 |
| [2] |
MA Y, LIU H, WU J, et al. The adverse health effects of bisphenol A and related toxicity mechanisms[J]. Environ Res, 2019, 176: 108575. DOI:10.1016/j.envres.2019.108575 |
| [3] |
AGARWAL R, JOSHI SS. Toxicity of bisphenol in pregnant females: first review of literature in humans[J]. Cureus, 2023, 15(5): e39168. DOI:10.7759/cureus.39168 |
| [4] |
ZHANG Y, DONG T, HU W, et al. Association between exposure to a mixture of phenols, pesticides, and phthalates and obesity: comparison of three statistical models[J]. Environ Int, 2019, 123: 325-336. DOI:10.1016/j.envint.2018.11.076 |
| [5] |
KAHN LG, PHILIPPAT C, NAKAYAMA SF, et al. Endocrine-disrupting chemicals: implications for human health[J]. Lancet Diabetes Endocrinol, 2020, 8(8): 703-718. DOI:10.1016/S2213-8587(20)30129-7 |
| [6] |
THOENE M, RYTEL L, DZIKA E, et al. Bisphenol A causes liver damage and selectively alters the neurochemical coding of intrahepatic parasympathetic nerves in juvenile porcine models under physiological conditions[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(12): 2726. DOI:10.3390/ijms18122726 |
| [7] |
MURATA M, KANG JH. Bisphenol A (BPA) and cell signaling pathways[J]. Biotechnol Adv, 2018, 36(1): 311-327. DOI:10.1016/j.biotechadv.2017.12.002 |
| [8] |
STRAKOVSKY R, WANG H, ENGESETH N, et al. Developmental bisphenol A (BPA) exposure leads to sex-specific modification of hepatic gene expression and epigenome at birth that may exacerbate high-fat diet-induced hepatic steatosis[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2015, 284(2): 101-112. DOI:10.1016/j.taap.2015.02.021 |
| [9] |
MARMUGI A, LASSERRE F, BEUZELIN D, et al. Adverse effects of long-term exposure to bisphenol A during adulthood leading to hyperglycaemia and hypercholesterolemia in mice[J]. Toxicology, 2014, 325: 133-143. DOI:10.1016/j.tox.2014.08.006 |
| [10] |
LEHMLER HJ, LIU BY, GADOGBE M, et al. Exposure to bisphenol A, bisphenol F, and bisphenol S in U.S. adults and children: the national health and nutrition examination survey 2013-2014[J]. ACS Omega, 2018, 3(6): 6523-6532. DOI:10.1021/acsomega.8b00824 |
| [11] |
LIU Y, ZHANG S, SONG N, et al. Occurrence, distribution and sources of bisphenol analogues in a shallow Chinese freshwater lake (Taihu Lake): implications for ecological and human health risk[J]. Sci Total Environ, 2017, 599-600: 1090-1098. DOI:10.1016/j.scitotenv.2017.05.069 |
| [12] |
LIU AF, QU GB, YU M, et al. Tetrabromobisphenol-A/S and nine novel analogs in biological samples from the Chinese Bohai Sea: implications for trophic transfer[J]. Environ Sci Technol, 2016, 50(8): 4203-4211. DOI:10.1021/acs.est.5b06378 |
| [13] |
LIU J, ZHANG L, LU G, et al. Occurrence, toxicity and ecological risk of Bisphenol A analogues in aquatic environment-a review[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2021, 208: 111481. DOI:10.1016/j.ecoenv.2020.111481 |
| [14] |
ZHANG H, ZHANG Y, LI J, et al. Occurrence and exposure assessment of bisphenol analogues in source water and drinking water in China[J]. Sci Total Environ, 2019, 655: 607-613. DOI:10.1016/j.scitotenv.2018.11.053 |
| [15] |
LIU Y, YAN Z, ZHANG Q, et al. Urinary levels, composition profile and cumulative risk of bisphenols in preschool-aged children from Nanjing suburb, China[J]. Ecotoxicol Environ Sa, 2019, 172: 444-450. DOI:10.1016/j.ecoenv.2019.02.002 |
| [16] |
PENG J, DU LL, MA QL. Serum glycolipids mediate the relationship of urinary bisphenols with NAFLD: analysis of a population-based, cross-sectional study[J]. Environ Health, 2023, 21(1): 1-14. DOI:10.1186/s12940-022-00945-w |
| [17] |
LIU Q, SHAO WT, WENG ZK, et al. In vitro evaluation of the hepatic lipid accumulation of bisphenol analogs: a high-content screening assay[J]. Toxicol Vitro, 2020, 68: 104959. DOI:10.1016/j.tiv.2020.104959 |
| [18] |
雷佩玉. 亚硫酸钠对HL-7702肝细胞极低密度脂蛋白组装途径的影响[D]. 太原: 山西医科大学, 2012. DOI: 10.7666/d.y2126716.
|
| [19] |
ALVES-BEZERRA M, COHEN DE. Triglyceride metabolism in the liver[J]. Compr Physiol, 2017, 8(1): 1-8. DOI:10.1002/cphy.c170012 |
| [20] |
卞京, 陈平洋, 卞读军, 等. Lipin基因表达与宫内发育迟缓大鼠肝脏脂肪含量的相关性研究[J]. 中国当代儿科杂志, 2022, 24(4): 440-446. DOI:10.7499/j.issn.1008-8830.2110130 |
| [21] |
RODGERS A, SFERRUZZI-PERRI AN. Developmental programming of offspring adipose tissue biology and obesity risk[J]. Int J Obes (Lond), 2021, 45(6): 1170-1192. DOI:10.1038/s41366-021-00790-w |
| [22] |
贺真, 白剑英, 李耀福, 等. 邻苯二甲酸单乙基己基酯对HepG2细胞内三酰甘油合成的影响[J]. 环境与职业医学, 2019, 36(4): 339-344. DOI:10.13213/j.cnki.jeom.2019.18806 |
| [23] |
MILLAR JS, STONE SJ, TIETGE UJF, et al. Short-term overexpression of DGAT1 or DGAT2 increases hepatic triglyceride but not VLDL triglyceride or apoB production[J]. J Lipid Res, 2006, 47(10): 2297-2305. DOI:10.1194/jlr.m600213-jlr200 |
| [24] |
ZHANG JF, CHOI SH, LI Q, et al. Overexpression of DGAT2 stimulates lipid droplet formation and triacylglycerol accumulation in bovine satellite cells[J]. Animals (Basel), 2022, 12(14): 1847. DOI:10.3390/ani12141847 |