2023, Vol. 52文章信息
- 高媛, 周新佳, 周妍, 赵立
- GAO Yuan, ZHOU Xinjia, ZHOU Yan, ZHAO Li
- IL-9及其受体通过STAT3通路激活巨噬细胞促进慢性阻塞性肺疾病进展
- IL-9 and its receptors promote progression of chronic obstructive pulmonary disease via activation of macrophages through STAT3 pathway
- 中国医科大学学报, 2023, 52(10): 921-927
- Journal of China Medical University, 2023, 52(10): 921-927
-
文章历史
- 收稿日期：2023-01-10
- 网络出版时间：2023-10-16 18:59:25
引用本文 |
2. 中国医科大学附属盛京医院 耳鼻咽喉头颈外科, 沈阳 110004
2. Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004, China
慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 是一种常见的慢性气道炎症疾病，严重危害人类身体健康[1]。研究[2]表明，免疫失衡在COPD中起重要作用。作为免疫调节的中心环节，辅助T细胞及其产生的细胞因子参与黏膜炎症的各种免疫反应[3-4]。白细胞介素-9 (interlukin-9，IL-9) 是一种多功能细胞因子，主要由活化的Th9细胞分泌。IL-9与IL-9受体(IL-9 receptor，IL-9R) 结合后，激活STAT3通路，启动一系列基因表达，发挥相应的生物学作用[5]。既往研究[6]表明，COPD患者肺组织中IL-9的表达上调。此外，也有研究[7]表明IL-9促进COPD疾病进展，具体机制可能与氧化应激有关。
巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，通过抗原呈递参与炎症反应的发生、发展，是COPD免疫致病机制的关键环节[8-9]。巨噬细胞具有高度可塑性，当受到微环境的刺激时，其表型和功能会发生适应性变化[10]。香烟烟雾可诱导巨噬细胞活化并增加数量。活化的巨噬细胞释放趋化因子和基质金属酶，促进炎症并破坏肺微环境[11]。JAK/STAT3是COPD发生发展的重要信号通路之一。它参与多种细胞因子的信号转导，影响T细胞的分化。有研究[12]表明，IL-9与IL-9R结合可以激活巨噬细胞。目前，IL-9在COPD发展中的调控机制尚未阐明，IL-9在COPD病程中对巨噬细胞功能的影响亦不清楚。本研究通过构建香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型，探讨IL-9及IL-9R在COPD进展中的作用机制。
1 材料与方法 1.1 材料及实验动物红双喜香烟(烟尼古丁含量1.2 mg/支，焦油含量15 mg/支)购自上海卷烟厂。IL-9多克隆抗体(bs-2428R)、P-STAT3抗体(bs-1658R) 和基质金属蛋白酶12 (matrix metalloproteinase，MMP12) 抗体(bs-1854R) 购自北京Bioss公司。IL-9R抗体(ab233757) 购自英国Abcam公司，STAT3抗体(#12640S)、GAPDH (#5174S) 购自美国CST公司，p-STAT3 (sc-8059P) 购自美国Santa Cruz公司。白细胞介素-6 (interleukin-6，IL6) 检测试剂盒(SEA079Hu) 购自美国USCN公司，肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) 检测试剂盒(SEA133Hu) 购自美国USCN公司，MMP-12检测试剂盒(SEA402Hu) 购自美国USCN公司。AG490 (CSGC13854) 购自武汉科斯坦生物科技公司。小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S) 购自上海酶研生物科技有限公司。24只雄性C57BL/6小鼠(8周龄，体质量20~25 g) 购自辽宁长生生物技术公司。
1.2 实验分组及香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型建立小鼠在(22±2) ℃、相对湿度(55±15) %、光照12 h/黑暗12 h的清洁环境中饲养。应用随机数字表将24只小鼠均分为3组: 吸烟组[CS组，每天放置在舱内，建立香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型(香烟暴露: 10支/次，2次/d，60 min/次，5 d/周，连续暴露6个月)]、戒烟组[cession-CS组，小鼠每天置于舱内，连续香烟暴露(10支/次，2次/d，60 min/次，5 d/周) 6个月，停止烟雾暴露6个月]、对照组(小鼠暴露于过滤空气中，除香烟暴露外，其他条件与吸烟组相同，连续暴露6个月)。3组均在实验后24 h内腹腔麻醉小鼠(10%水合氯醛溶液，0.3 mL/100 g)，通过眶后动脉放血处死。取出左肺，10%甲醛灌注左肺下叶，使之膨胀后再用10%甲醛固定48 h后石蜡包埋保存备用。右肺组织迅速移至-80 ℃冰箱保存备用。本研究经中国医科大学盛京医院动物伦理委员会批准(批准文号: 2016PS179K)。
小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)给予不同浓度(0、10、30 ng /mL) IL-9干预，干预2、4、6、12 h时检测IL-6、TNF-α、MMP-12水平。进一步将小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S) 分为对照组、干预组(加入30 ng /mL IL-9干预12 h)、AG490+IL-9干预组(加入AG490、30 ng/mL IL-9干预12 h)。采用PCR及Western blotting检测STAT3、p-STAT3及MMP-12的表达情况。
1.3 方法 1.3.1 HE染色取石蜡包埋的肺组织，在距肺门3 mm处连续水平切片(厚度3~4 µm)。乙醇和二甲苯脱蜡至水，苏木精浸渍，1%盐酸乙醇分化，0.5%伊红溶液复染，透明盖玻片脱水。每张切片在10倍物镜下随机选取10个非重复视野，在100倍物镜下采集图像，由2位病理医生读片，获得肺泡间隔(linear intercept，Lm) 和肺泡破坏指数(destructive index，DI)。Lm反映肺泡直径，具体测量方法: 避开大血管和支气管，在视野的中心画十字，计算与十字相交的肺泡间隔数，测量十字的总长度，根据Lm=十字总长度/肺泡格数来计算。DI反映肺泡壁结构的破坏程度，具体测量方法: 目镜内放置一个标有42个点的计数网格。如果视野中的标记点落在所见的肺泡腔或肺泡囊腔内，则记为肺泡正常(normal alveolar and/or duct spaces，N) 或肺泡破坏(destroyed alveolar and/or duct spaces，D)；如果标记点落在其他结构上则不记录。计算DI=D /(D + N)。
1.3.2 免疫组织化学染色取3组石蜡包埋肺组织，切片、脱蜡、水化后，抗原修复，用3%过氧化氢去除内源性氧化酶，山羊血清封闭，滴加一抗(1∶400)、二抗PBS洗片孵育，DAB显色、复染、封片。各型炎症细胞以胞质和(或) 胞膜呈棕黄色或棕褐色判定为阳性表达[13]。采用奥林巴斯光学显微镜(40倍) 观察切片，通过Image-ProPlusV6.O图像软件分析3组阳性表达结果。
1.3.3 ELISA检测小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S) 于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，通过加入不同浓度(0、10、30 ng /mL) IL-9干预MH-S细胞，在干预2、4、6、12 h后使用检测试剂盒检测TNF-α、IL-6和MMP-12的表达水平，操作均按照试剂盒说明书进行。
1.3.4 实时定量PCR (real-time quantitative PCR，qRT-PCR)使用Mini BEST Universal RNA Extraction Kit (9767，日本TaKaRa公司) 提取3组小鼠肺组织标本及肺泡巨噬细胞总RNA，并使用PrimeScriptTM RT Master MIX (RR036A，日本TaKaRa公司) 合成cDNA模板。使用紫外分光光度法测定RNA浓度和纯度。采用One Step SYBR® PrimeScriptTM RT-PR KitⅡ(日本TaKaRa公司) 将0.5 μg总RNA逆转为cDNA。使用BIO-RAD (美国伯乐公司) 进行检测。引物序列: β-actin，正向5’-GCAGAAGGAGATTACTGCTCT-3’，反向5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’；IL-9，正向5’-CTGCTTGTGTCTCTCCGT-3’，反向5’-GACTTCAACTATCCTTTTCACC-3’；IL-9R，正向5’-GCTTTGTCCACCTTCTGTT-3’，反向5’-CACCATTCTGTCTTGCTTG-3’；MMP-12，正向5’-ATTTCCACACACTTCCCA-3’，反向5’-ACCCTTCACTACATTCTTCCT-3’；STAT3，正向5’-TCTACCTCTACCCCGACATT-3’，反向5’-ACTCAAACTGCCCTCCTG-3’。扩增产物长度为135 bp。利用2-ΔΔCt计算基因表达水平。
1.3.5 Western blotting检测提取组织总蛋白，采用BCA法定量。按每孔30 μg蛋白量进行电泳，将分离的蛋白转膜、封闭、加入一抗孵育。用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水洗涤膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗。室温孵育1 h，洗膜后显色。采用江苏捷达801成像系统分析IL-9、IL-9R、STAT3、p-STAT3、MMP-12蛋白的吸光度。相对蛋白含量采用目标蛋白条带值/内参GAPDH条带值表示。
1.4 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0进行统计分析，计量资料以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析。组间两两比较方差一致的采用Bonferroni检验，方差不一致的采用Dunnett’s T 3检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 3组小鼠气道炎症及肺泡损伤结果HE染色结果(图 1A) 显示，对照组小鼠肺泡结构完整，无明显炎症细胞浸润。CS组小鼠支气管壁、血管壁、肺泡均有明显的炎性细胞浸润，杯状细胞有不同程度增殖。与对照组比较，CS组肺泡腔变大，肺泡间隔破裂。肺大泡融合，炎症细胞浸润明显。cession-CS组小鼠肺泡腔扩大，肺泡间隔破裂，炎症细胞浸润程度较CS组加重。进一步分析结果表明，CS组和cession-CS组Lm和DI均显著高于对照组(P < 0.001)。与CS组比较，cession-CS组Lm和DI显著升高(P < 0.05)。见图 1B。表明香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型建立成功。香烟烟雾暴露对小鼠肺组织造成严重损害，并且戒烟后损害仍然加重。
|
| A, HE staining (×200, ×40);B, Lm;C, DI. * P < 0.05, *** P < 0.001. 图 1 3组肺组织HE染色及病理形态学定量分析结果 Fig.1 HE staining and histopathologic quantitative analysis of lung tissue in 3 groups |
2.2 各组小鼠肺组织IL-9、IL-9R表达变化
免疫组织化学结果显示，IL-9和IL-9R阳性细胞分布于肺泡壁、气道壁和巨噬细胞壁。IL-9主要在浸润性炎症细胞中表达。CS组及cession-CS组肺泡壁和小气道IL-9和IL-9R阳性表达高于对照组(均P < 0.05)；而CS组IL-9和IL-9R阳性表达高于cession-CS组(P < 0.05)，见图 2。
|
| A, HE staining (×200, ×40) and stastical analysis of IL-9;B, HE staining (×200, ×40) and stastical analysis of IL-9R. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. 图 2 免疫组织化学检测各组肺组织中IL-9和IL-9R阳性表达 Fig.2 Positive expressions of IL-9 and IL-9R in lung tissues of each group determined using immunohistochemistry |
2.3 各组小鼠肺组织IL-9、IL-9R、STAT3、p-STAT3、MMP-12表达
通过qRT-PCR及Western blotting检测小鼠肺组织IL-9、IL-9R、STAT3、p-STAT3、MMP-12表达的变化。结果显示，与对照组比较，CS组小鼠肺组织IL-9、IL-9R、STAT3和MMP-12表达显著升高(均P < 0.01)。与CS组比较，cession-CS组IL-9、IL-9R、STAT3和MMP-12表达显著降低(均P < 0.05)，见图 3A。进一步Western blot-ting检测结果显示，与对照组比较，CS组小鼠肺组织IL-9、IL-9R、p-STAT3和MMP-12表达显著升高(P < 0.01)。与CS组比较，cession-CS组小鼠肺组织IL-9、IL-9R、p-STAT3及MMP-12水平降低(P < 0.01)，但仍显著高于对照组，见图 3B。
|
| A, qRT-PCR results; B, Western blotting results. * P < 0.000 1, ** P < 0.01. 图 3 3组小鼠肺组织中IL-9、IL-9R、MMP-12、STAT3表达比较 Fig.3 Comparison of IL-9, IL-9R, MMP-12, and STAT3 expressions in lung tissue of mice in 3 study groups |
2.4 不同浓度IL-9对肺泡巨噬细胞炎症反应的影响
ELISA检测结果显示，与0 ng /mL IL-9比较，10、30 ng /mL IL-9干预2、4、6、12 h时肺泡巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α和MMP-12水平逐渐增加(P < 0.05)。与0 ng /mL IL-9比较，30 ng /mL IL-9干预12 h肺泡巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α和MMP-12水平增加更明显(均P < 0.000 1)。可见，随着IL-9浓度增加，肺泡巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6和MMP-12的水平也提高，见图 4。
|
| A, IL-6;B, TNF-α; C, MMP-12. * P < 0.000 1, **P < 0.001. 图 4 不同浓度(0、10、30 ng /mL) IL-9刺激肺泡巨噬细胞分泌的IL-6、TNF-α和MMP-12的水平比较 Fig.4 Comparison of IL-6, TNF-α, and MMP-12 levels secreted by alveolar macrophages stimulated by different concentrations of IL-9 |
2.5 IL-9通过JAK/STAT3通路促进巨噬细胞活化
AG490可抑制JAK的激活，进而抑制下游因子p-STAT3水平。进一步将小鼠肺泡巨噬细胞分为对照组、IL-9 (30 ng /mL) 组、AG490+IL-9组，观察IL-9通过JAK/STAT3通路对MMP-12转录的影响。PCR结果显示，与对照组比较，IL-9组MMP-12表达上调，而AG490+IL-9组逆转了这种上调(均P < 0.001)。Western blotting检测结果显示，与对照组比较，IL-9组MMP-12、p-STAT3表达升高，STAT3表达下降(均P < 0.05)；与IL-9组比较，AG490+ IL-9组MMP-12、p-STAT3表达下降，而STAT3表达升高(均P < 0.05)。表明IL-9通过JAK/STAT3通路促进MMP-12的转录。见图 5。
|
| A, PCR; B, Western blotting. *** P < 0.001, * P < 0.05, ** P < 0.01. 图 5 IL-9通过JAK/STAT3通路促进巨噬细胞活化 Fig.5 IL-9 promotes macrophage activation through the JAK/STAT3 pathway |
3 讨论
COPD是一种进行性慢性气道炎症疾病，临床表现为不完全可逆的气流受限和肺功能下降[14]。吸烟是发生COPD的主要危险因素。炎症反应是COPD的核心机制，主要影响小气道和肺实质，引起小气道阻塞[15]。戒烟后COPD炎症并不能完全消除，COPD患者戒烟后肺部炎症持续存在，并继续发展为肺气肿[16]。本研究构建了香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型。结果表明，戒烟后很长时间吸烟引起的损害仍然持续存在，与以往研究结果一致。
免疫调节在炎症的发展中起重要作用。多项研究表明，CD4+T细胞亚群(包括Th1、Th2、Th17和调节性T细胞) 介导的免疫反应在COPD的发生发展中起重要作用。Th9细胞由VELDHOEN等[17]和DARDALHON等[18]发现，是CD4+T淋巴细胞的一个新亚群。研究[19-20]显示Th9细胞及其分泌的细胞因子IL-9参与免疫介导的疾病。哮喘或接触性皮炎患者外周血中Th9细胞明显增加，提示Th9细胞可能与过敏性疾病的发病有关。近期关于COPD的研究[5-6]表明，COPD患者诱导痰液中IL-9水平显著升高，提示IL-9参与了疾病进展。本研究免疫组化、Western blotting和PCR检测结果显示，香烟烟雾暴露诱导的COPD小鼠IL-9和下游信号通路激活。而戒烟后小鼠肺部IL-9和下游的STAT3/MMP-12通路仍处于过度激活状态。这些结果表明IL-9在COPD的疾病进展中起重要作用，在戒烟后也是持续气道重塑和肺气肿进展的重要因素。
IL-9R属于γ链细胞因子受体家族，由一条α链和一条γ链组成[21]。IL-9R在许多免疫细胞(肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和巨噬细胞) 中表达[22]。其中，巨噬细胞是连接先天免疫和适应性免疫的重要桥梁，是呼吸道和肺部抵御微生物感染的第一道防线。巨噬细胞活化在肺部疾病，尤其是COPD中起着至关重要的作用。本研究结果显示，随着IL-9干预浓度的增加，小鼠肺泡巨噬细胞炎性细胞因子TNF-α、IL-6和MMP-12分泌显著增加，表明IL-9通过受体IL-9R影响巨噬细胞炎症反应。研究[23]表明，IL-9与靶细胞表面的IL-9R结合后，激活JAK/STAT3通路，启动一系列炎性细胞因子转录，从而发挥生物学效应。本研究结果表明，Th9细胞分泌的IL-9通过JAK/STAT3通路促进巨噬细胞活化，与以往研究结果一致。
综上所述，香烟烟雾诱导的COPD小鼠IL-9及其下游信号通路激活；而戒烟后小鼠肺气肿持续加重，IL-9及其下游信号通路持续激活。IL-9及IL-9R通过STAT3通路激活巨噬细胞，促进COPD进展。本研究存在一定局限性: IL-9调控巨噬细胞功能的具体机制尚未明确；此外，缺乏临床病理标本的验证，因此仍需进一步研究论证。
| [1] |
SINGH D, AGUSTI A, ANZUETO A, et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease: the GOLD science committee report 2019[J]. Eur Respir J, 2019, 53(5): 1900164. DOI:10.1183/13993003.00164-2019 |
| [2] |
LANE NN, ROBINS RA, CORNE J, et al. Regulation in chronic obstructive pulmonary disease: the role of regulatory T-cells and Th17 cells[J]. Clin Sci, 2010, 119(2): 75-86. DOI:10.1042/CS20100033 |
| [3] |
BARNES PJ. Targeting cytokines to treat asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J]. Nat Rev Immunol, 2018, 18(7): 454-466. DOI:10.1038/s41577-018-0006-6 |
| [4] |
THOMAS R, QIAO S, YANG X. Th17/treg imbalance: implications in lung inflammatory diseases[J]. Int J Mol Sci, 2023, 24(5): 4865. DOI:10.3390/ijms24054865 |
| [5] |
SCHMITT E, BOPP T. Discovery and initial characterization of Th9 cells: the early years[J]. Semin Immunopathol, 2017, 39(1): 5-10. DOI:10.1007/s00281-016-0610-0 |
| [6] |
PANZNER P, LAFITTE JJ, TSICOPOULOS A, et al. Marked up-regulation of T lymphocytes and expression of interleukin-9 in bronchial biopsies from patients with chronic bronchitis with obstruction[J]. Chest, 2003, 124(5): 1909-1915. DOI:10.1378/chest.124.5.1909 |
| [7] |
ZOU SC, PANG LL, MAO QS, et al. IL-9 exacerbates the development of chronic obstructive pulmonary disease through oxidative stress[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2018, 22(24): 8877-8884. DOI:10.26355/eurrev_201812_16656 |
| [8] |
BARNES PJ. Inflammatory mechanisms in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Allergy Clin Immunol, 2016, 138(1): 16-27. DOI:10.1016/j.jaci.2016.05.011 |
| [9] |
LEE JW, CHUN W, LEE HJ, et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases[J]. Cells, 2021, 10(4): 897. DOI:10.3390/cells10040897 |
| [10] |
SHAPOURI-MOGHADDAM A, MOHAMMADIAN S, VAZINI H, et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease[J]. J Cell Physiol, 2018, 233(9): 6425-6440. DOI:10.1002/jcp.26429 |
| [11] |
BYRNE AJ, MATHIE SA, GREGORY LG, et al. Pulmonary macrophages: key players in the innate defence of the airways[J]. Thorax, 2015, 70(12): 1189-1196. DOI:10.1136/thoraxjnl-2015-207020 |
| [12] |
ZHANG WC, TANG TT, NIE DA, et al. IL-9 aggravates the development of atherosclerosis in ApoE-/- mice[J]. Cardiovasc Res, 2015, 106(3): 453-464. DOI:10.1093/cvr/cvv110 |
| [13] |
HAUBER HP, BERGERON C, TSICOPOULOS A, et al. Increased expression of the calcium-activated chloride channel in Hclca1 in airways of patients with obstructive chronic bronchitis[J]. Can Respir J, 2005, 12(3): 143-146. DOI:10.1155/2005/531432 |
| [14] |
CHRISTENSON SA, SMITH BM, BAFADHEL M, et al. Chronic obstructive pulmonary disease[J]. Lancet, 2022, 399(10342): 2227-2242. DOI:10.1016/s0140-6736(22)00470-6 |
| [15] |
CARAMORI G, RUGGERI P, DI STEFANO A, et al. Autoimmunity and copd[J]. Chest, 2018, 153(6): 1424-1431. DOI:10.1016/j.chest.2017.10.033 |
| [16] |
MILLER M, CHO JY, PHAM A, et al. Persistent airway inflammation and emphysema progression on CT scan in ex-smokers observed for 4 years[J]. Chest, 2011, 139(6): 1380-1387. DOI:10.1378/chest.10-0705 |
| [17] |
VELDHOEN M, UYTTENHOVE C, VAN SNICK J, et al. Transforming growth factor- β 'reprograms' the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9-producing subset[J]. Nat Immunol, 2008, 9(12): 1341-1346. DOI:10.1038/ni.1659 |
| [18] |
DARDALHON V, AWASTHI A, KWON H, et al. IL-4 inhibits TGF- β-induced Foxp3+ T cells and, together with TGF- β, generates IL-9+ IL-10+ Foxp3-effector T cells[J]. Nat Immunol, 2008, 9(12): 1347-1355. DOI:10.1038/ni.1677 |
| [19] |
HOPPENOT D, MALAKAUSKAS K, LAVINSKIENĖ S, et al. Peripheral blood Th9 cells and eosinophil apoptosis in asthma patients[J]. Medicina, 2015, 51(1): 10-17. DOI:10.1016/j.medici.2015.01.001 |
| [20] |
LIU J, HARBERTS E, TAMMARO A, et al. IL-9 regulates allergen-specific Th1 responses in allergic contact dermatitis[J]. J Investig Dermatol, 2014, 134(7): 1903-1911. DOI:10.1038/jid.2014.61 |
| [21] |
FU YY, WANG J, ZHOU BH, et al. An IL-9-pulmonary macrophage axis defines the allergic lung inflammatory environment[J]. Sci Immunol, 2022, 7(68): eabi9768. DOI:10.1126/sciimmunol.abi9768 |
| [22] |
LI HM, ROSTAMI A. IL-9:basic biology, signaling pathways in CD4+ T cells and implications for autoimmunity[J]. J Neuroimmune Pharmacol, 2010, 5(2): 198-209. DOI:10.1007/s11481-009-9186-y |
| [23] |
KALBASI A, SIURALA M, SU LL, et al. Potentiating adoptive cell therapy using synthetic IL-9 receptors[J]. Nature, 2022, 607(7918): 360-365. DOI:10.1038/s41586-022-04801-2 |